К здоровья 1978 иммунологические исследования лизис лейкоцитов. Совершенствование ранней диагностики туберкулеза животных
Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использован для экспресс-диагностики миксоматоза кроликов. Сущность способа состоит в том, что проводят реакцию специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) с использованием противомиксоматозной вакцины из штамма В-82, рассчитывают показатель РСЛЛ и при его значении 10% и более диагностируют миксоматоз. Техническим результатом является разработка способа, позволяющего провести ускоренную диагностику на ранней стадии заболевания, а также выявить бессимптомное течение миксоматоза. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.
Изобретение относится к ветеринарии, в частности к экспресс-методам диагностики миксоматоза.
Известны различные способы диагностики миксоматоза кроликов, в том числе обнаружение антигенов в пораженной коже с помощью флуоресцирующих антител, выявление антител, циркулирующих иммунных комплексов с использованием реакций связывания комплемента, реакции иммунодиффузии, реакции нейтрализации и иммуноферментного анализа (Гуненко В.В. и др. О диагностике и профилактике миксоматоза кроликов. Ветеринария, 1987, т.12, с.44-45). Недостатками известных способов являются трудоемкость, наличие дорогостоящего оборудования, невозможность определения наличия вируса в первые дни после заражения.
Целью изобретения является сокращение сроков обнаружения в организме животного возбудителя миксоматоза. Обнаружение возможно начиная с трех-шести часов после заражения.
Достижение поставленной цели основано на феномене немедленной активации, повышенной чувствительности и перенапряжении иммунокомпетентных клеток крови - лейкоцитов - на повторное воздействие вне организма того же антигена, который до этого внедрился в организм.
Способ диагностики миксоматоза кроликов осуществляется следующим образом. У исследуемого животного берут пробу крови. В опытную пробирку, содержащую 0,05 мл 3,8%-ного раствора цитрата натрия, вносят 0,1 мл исследуемой крови и рабочую дозу антигена - 0,05 мл вакцины против миксоматоза кроликов сухой живой культуральной из штамма "В-82" в разведении одна иммунизирующая доза на один мл физиологического раствора. Контрольную пробирку заполняют в том же объеме, но физиологический раствор - без антигена.
Пробирки инкубируют в термостате в течение двух часов при температуре +37°С, встряхивая через каждые 30 минут. Затем для разрушения эритроцитов из контрольной и опытной пробирки по 0,02 мл крови переносят в пробирки с 0,4 мл 3%-ного раствора уксусной кислоты и подкрашивают генцианвиолетом. Подсчитывают число лейкоцитов в обеих пробах в камере Горяева и рассчитывают показатель реакции специфического лизиса лейкоцитов (в процентах) по формуле:
РСЛЛ считают положительной при показателе 10% и выше.
В случае сильного лейкоцитоза, когда затруднительно провести подсчет лейкоцитов, исследуемые контрольные и опытные пробы крови, дополнительно разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1 или 1:2.
Для определения рабочей дозы антигена (вакцины против миксоматоза кроликов сухой живой культуральной из штамма "В-82") отобрали десять здоровых кроликов. Кровь от каждого кролика разделили на три пробы. В три пробирки с 0,05 мл 3%-ного раствора цитрата натрия внесли по 0,1 мл исследуемой крови. Затем в первую пробирку внесли 0,05 мл антигена - вакцины против миксоматоза кроликов сухой живой культуральной из штамма "В-82" в разведении четыре иммунизирующих дозы препарата на один мл физиологического раствора, во вторую - 0,05 мл вакцины в разведении две иммунизирующих дозы на один мл физиологического раствора, в третью - 0,05 мл вакцины в разведении одна иммунизирующая доза на один мл физиологического раствора.
Пробирки инкубировали в течение двух часов при температуре +37°, встряхивая через каждые 30 минут. Затем для разрушения эритроцитов из контрольных и опытных пробирок по 0,02 мл крови перенесли в пробирки с 0,4 мл 3%-ного раствора уксусной кислоты и подкрасили генцианвиолетом. Далее подсчитали число лейкоцитов во всех пробирках в камере Горяева и рассчитали показатель реакции специфического лизиса лейкоцитов (в процентах) по формуле:
где Лк и Ло - абсолютное количество лейкоцитов в контрольной и опытной пробе.
РСЛЛ для здоровых кроликов должна быть ниже 10%. Результаты представлены в табл. 1.
Как видно из таблицы 1 РСЛЛ во всех пробах не превышала 10%, поэтому рациональнее в качестве рабочей дозы антигена взять разведение вакцины против миксоматоза кроликов, сухой живой культуральной из штамма "В-82" из расчета одна иммунизирующая доза на один мл физиологического раствора.
Для ретроспективной диагностики миксоматоза в неблагополучном хозяйстве исследовали кровь кроликов.
На основании результатов клинического состояния кроликов были сформированы 4 группы животных по 5 голов в каждой (табл.2).
Первая группа - кролики-вирусоносители, со скрытой формой миксоматоза - находились в контакте с больными, но без клинических изменений. У отдельных были заметны бесшерстные участки, свидетельствующие об миксомных узлах в прошлом.
Во вторую группу - клинически больные миксоматозом - отобрали больных кроликов с отеками век, оснований ушных раковин, аногенетальной области, спины, с узелковыми ограниченными образованиями в коже ушей, головы и век.
Кролики третьей группы были вакцинированы с целью установления динамики лизиса лейкоцитов с момента внедрения миксоматозного антигена в организм животного, и для выявления особенностей реакции лизиса лейкоцитов у вакцинированных по сравнению с вирусоносителями.
Кролики четвертой группы - клинически здоровы и не инфицированы вирусом миксоматоза, служат контролем.
У животных всех групп определяли показатель реакции специфического лизиса лейкоцитов. Для этого у животных брали пробы крови. Каждую пробу делили на опытную и контрольную. В опытную пробирку, содержащую 0,05 мл 3,8%-ного раствора цитрата натрия, вносили 0,1 мл исследуемой крови и рабочую дозу антигена - 0,05 мл вакцины против миксоматоза кроликов сухой живой культуральной из штамма "В-82" в разведении одна иммунизирующая доза на один мл физиологического раствора. Контрольную пробирку заполняли в том же объеме, но физиологический раствор - без антигена.
Пробирки инкубировали в термостате в течение двух часов при температуре +37°С, встряхивая через каждые 30 минут. Затем для разрушения эритроцитов из контрольной и опытной пробирки по 0,02 мл крови перенесли в пробирки с 0,4 мл 3%-ного раствора уксусной кислоты и подкрасили генцианвиолетом. Подсчитали число лейкоцитов в обеих пробах в камере Горяева и рассчитали показатель реакции специфического лизиса лейкоцитов (в процентах) по формуле:
где Лк и Ло - абсолютное количество лейкоцитов в контрольной и опытной пробе.
РСЛЛ считали положительной при показателе 10% и выше.
Результаты представлены в таблице 2.
| Таблица 2 Показатели РСЛЛ у кроликов, больных миксоматозом, вакцинированных и здоровых |
||||
| Группы подопытных кроликов | РСЛЛ, в % | Продолжительность наблюдений в сутках | Снижение % лизиса в среднем в сутки (%) | |
| в начале исследования | в конце исследования | |||
| 1. Скрытая форма, вирусоносители. | 30-42 | 29-38 | 10 | 0,25 |
| 2. Клинически больные миксоматозом | 62-77 | 60-71 | 10 | 0,40 |
| 3. Вакцинированные противомиксоматозной вакциной | 29-36 | 21-28 | 10 | 0,80 |
| 4. Интактные контрольные | 4-9 | 4-9 | 10 | 0 |
Как видно из таблицы 2, скорость снижения процента лизиса лейкоцитов у вакцинированных кроликов в 3,2 раза больше, чем у кроликов-вирусоносителей со скрытой формой миксоматоза, и 2 раза больше, чем у клинически больных. У больных с клинической формой миксоматоза процент лизиса лейкоцитов за весь период наблюдений был очень высокий, достигал 60-77%.
В группе вакцинированных кроликов обнаруживали резкое увеличение процента лизиса лейкоцитов на третьи сутки. Это свидетельство того, что вакцины против миксоматоза кроликов сухой живой культуральной из штамма "В-82" вызывает состояние сенсибилизации лейкоцитов крови (ответственных за иммунитет) до образования в организме специфических антител.
Лизис лейкоцитов у интактных кроликов за весь период опыта не превышал 10%, т.е. находился в пределах нормы.
Исследование РСЛЛ позволяет диагнозцировать бессимптомное течение миксоматоза.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ диагностики миксоматоза кроликов, отличающийся тем, что проводят реакцию специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) с использованием противомиксоматозной вакцины из штамма В-82, рассчитывают показатель РСЛЛ и при его значении 10% и более диагностируют миксоматоз.
2. Способ диагностики миксоматоза кроликов по п.1, отличающийся тем, что при лейкоцитозе пробы крови перед подсчетом лейкоцитов разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1 или 1:2.
Изобретение относится к области биотехнологии. Способ включает выявление в благополучных хозяйствах и дворах плановыми аллергическими исследованиями реагирующих на туберкулин животных. От положительно реагирующих на туберкулин животных исследуют кровь реакцией специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) с использованием в качестве диагностикума туберкулинов ППД для млекопитающих, ППД для птиц и КАМ. Способ позволяет провести дифференциацию специфических и неспецифических положительных реакций на туберкулиновую пробу и диагностировать туберкулез на ранней стадии заболевания. 4 з.п. ф-лы, 7 табл.
Изобретение относится к ветеринарии, в частности к экспресс-способам дифференциальной диагностики туберкулеза, вызываемого микобактериями разных видов.
Известно, что в благополучных хозяйствах первичный диагноз на туберкулез устанавливают комплексным способом - эпизоотологическим, клиническим, аллергическим, патологоанатомическим и лабораторным (1.)
Перечисленные способы диагностики во многих случаях не позволяют в короткие сроки исследования поставить окончательный диагноз на туберкулез.
Для массовых прижизненных исследований на туберкулез используют аллергическую диагностическую пробу (2). Однако появление массовых неспецифических реакций на туберкулин у нетуберкулезных животных не позволяет поставить в благополучных хозяйствах диагноз на туберкулез по положительной туберкулиновой пробе (1; 2).
Для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций ставят симультанную пробу (прототип) с двумя аллергенами - ППД для млекопитающих и аллергеном КАМ, изготовленным из нескольких штаммов атипичных микобактерий (2; 3; 4).
Симультанную аллергическую пробу применяют при первичной постановке диагноза на туберкулез крупного и мелкого рогатого скота и кур в благополучных хозяйствах и в случае, если реакции на туберкулин обусловлены атипичными микобактериями и кислотоустойчивыми сапрофитами (3).
Владельцы высокоудойных коров оспаривают правомерность контрольно-диагностического убоя животных, давших положительную реакцию на туберкулиновую пробу, и требуют прижизненных способов диагностики для переисследования высокопродуктивных животных на туберкулез. Использование предлагаемого нами «Способа ранней диагностики туберкулеза животных» вносит ясность в этот спорный вопрос, так как позволяет установить однозначно специфичность или неспецифичность реакции организма животного на внутрикожное введение туберкулина и окончательно поставить диагноз.
Более того, проведение симультанной пробы допускается через 30 и более дней после последней туберкулинизации животных, что не отвечает требованиям ранней (доклинической) диагностики туберкулеза в короткие сроки исследования.
Таким образом, недостатками известных способов постановки диагноза на туберкулез являются трудоемкость, продолжительные сроки исследования и невозможность определения вида микобактерий в первые дни после заражения.
Способ основан на немедленно появляющейся повышенной чувствительности лейкоцитов к повторному контакту с антигеном (аллергеном) вне организма. Целью изобретения является разработка нового способа. Поставленная задача достигается использованием реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ).
Способ осуществляется путем исследования крови РСЛЛ от положительно реагирующих на туберкулин животных, выявленных в благополучных хозяйствах и дворах плановыми аллергическими исследованиями, с использованием в качестве диагностикума туберкулинов (ППД для млекопитающих, ППД для птиц и КАМ).
Причем при диагностике туберкулеза у крупного рогатого скота РСЛЛ проводится с ППД-туберкулином для млекопитающих, ППД-туберкулином для птиц и КАМ - комплексным аллергеном из атипичных микобактерий.
Диагностику туберкулеза у свиней выполняют с ППД-туберкулином для млекопитающих и ППД-туберкулином для птиц.
При диагностике туберкулеза у собак и плотоядных РСЛЛ используют ППД-туберкулин для млекопитающих.
Диагностику туберкулеза у кроликов и пушных зверей РСЛЛ проводят с ППД-туберкулином для млекопитающих, ППД-туберкулином для птиц и КАМ.
Организация исследований на туберкулез РСЛЛ
В опытах на кроликах, собаках, свиньях и телятах для сенсибилизации организма животных использовали живые микобактерии вакцинного штамма БЦЖ-1 в прививочных дозах: одна (0,05 мг), две (0,1 мг), три (0,15 мг), пять (0,25 мг) и десять (0,50 мг).
Исследования проводили в экспериментальных условиях на лейкоцитах крови интактных вакцинированных БЦЖ животных и в производственных условиях - коровах, дважды давших положительную реакцию на внутрикожное введение ППД-туберкулина для млекопитающих, в СПК « Рассвет» Матвеево-Курганского района.
Основная цель исследований - использовать результаты РСЛЛ для дифференциальной диагностики и определения:
1) сенсибилизации лейкоцитов организма животных микобактериями вакцины БЦЖ;
2) инфицирования коров, давших дважды положительную туберкулиновую реакцию;
3) неспецифических реакций на туберкулин при его внутрикожном введении.
В опыт отобрали клинически здоровых интактных животных, которые служили фоновым контролем. Группы формировали животными, у которых при 3-кратном исследовании проб крови получены стабильные величины значений гематологических показателей (количество лейкоцитов,% лизиса и др.).
В каждую опытную группу брали не менее трех животных. От каждого животного брали кровь, которую делили на контрольную и опытные пробы. В контрольной пробе к крови добавляли 0,9% физиологический раствор натрия хлорида, а в опытных пробах крови - туберкулины - ППД для млекопитающих, ППД для птиц и КАМ.
Для исключения ошибок внимания техники подсчета форменных элементов и получения достоверных средних величин значений показателей реакции крови каждую пробу (контрольную и опытные) исследовали в трех повторах.
Порядок проведения исследования на туберкулез РСЛЛ
Исследование животных на туберкулез вначале проводят методом туберкулинизации в порядке и сроки, предусмотренные «Эпизоотическим контролем и постановкой диагноза на туберкулез у животных разных видов» (2).
В качестве диагностикумов берут ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и комплексный аллерген из атипичных микобактерий (КАМ).
В благополучных по туберкулезу гуртах, группах и отдельных животных основным методом исследования является внутрикожная туберкулиновая проба. В случае выявления животных, реагирующих на туберкулин, то положительно реагирующих изолируют, ставят на привязь и берут от них кровь для исследования в реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) со следующими диагностикумами:
У крупного рогатого скота антикоагулянтную кровь в РСЛЛ берут с
а) физиологическим раствором хлористого натрия (контрольная проба);
г) ППД-туберкулином для птиц.
При этом животных, давших положительные результаты исследования РСЛЛ с ППД-туберкулином для млекопитающих, считают туберкулезными
У свиней антикоагулянтную кровь в РСЛЛ берут с
а) физиологическим раствором поваренной соли;
б) ППД-туберкулином для млекопитающих;
в) ППД-туберкулином для птиц.
Свиней, у которых РСЛЛ с ППД-туберкулином для млекопитающих оказалась положительной, признают туберкулезными, а животных, у которых РСЛЛ положительна с ППД-туберкулином для птиц, считают инфицированными микобактериями птичьего вида;
У собак и др. мелких животных РСЛЛ берут с
а) физиологическим раствором;
б) ППД-туберкулином для млекопитающих;
У кроликов антикоагулянтную кровь в РСЛЛ берут с
а) физиологическим раствором натрия хлорида;
б) ППД-туберкулином для млекопитающих;
в) ППД-туберкулином для птиц;
При этом кролики, давшие положительную РСЛЛ с ППД-туберкулином для млекопитающих, считаются инфицированными бычьим видом возбудителя туберкулеза, а с ППД-туберкулином для птиц - зараженными птичьим видом возбудителя, с КАМ - сенсибилизированными атипичными нетуберкулезными микобактериями.
Целью изобретения является сокращение сроков обнаружения в организме животных возбудителя туберкулеза и определение вида микобактерий, вызвавшего сенсибилизацию.
Достижение поставленной цели основано на явлении немедленного приобретения после внедрения возбудителя иммунокомпетентными клетками повышенной чувствительности организма, выявляемой при повторном воздействии вне организма того же антигена на лейкоциты крови. Повышенная чувствительность после инфицирования представляет собой клеточный феномен, в котором клетками-эффекторами, вступающими во взаимодействие с туберкулином вне организма, являются сенсибилизированные лейкоциты крови, что отличается от повышенной чувствительности замедленного типа (ПЧЗТ) организма, которая развивается у животных через 2-3 недели после заражения их возбудителем туберкулеза.
Осуществления способа
Способ ранней диагностики туберкулеза животных осуществляется следующим образом. В лунку планшета, содержащую 0,05 мл 3,8%-ного раствора цитрата натрия (гепарина, трилона Б или любой другой антикоагулянт) вносят 0,1 мл исследуемой крови и рабочую дозу туберкулина в объеме 0,05 мл (опытные пробирки). Контрольные пробирки заполняют в том же объеме физиологическим раствором без туберкулина. Кровь в лунках планшета инкубируют в течение 2 часов при t=37°C, встряхивая через каждые 30 минут. Затем из контрольной и опытной лунок по 0,02 мл крови переносят в лунку с 0,4 мл жидкостью Тюрка (3-5% раствор уксусной кислоты, подкрашенный несколькими каплями раствора метиленового синего) для разрушения эритроцитов и окраски ядер лейкоцитов. Подсчитывают число лейкоцитов (в камере Горяева) во всех лунках и рассчитывают показатели реакции специфического лизиса лейкоцитов (в процентах) по формуле
где Л к и Л о - абсолютное количество лейкоцитов в контрольной и опытной пробе. РСЛЛ считают положительной при показателе 10% и выше.
Пример 1. Рабочая доза туберкулинов
Схема опытов по определению рабочей дозы туберкулинов (соотношения антикоагулянта, крови и туберкулина)
В схеме опытов по определению рабочей дозы туберкулинов показано, что объемные соотношения антикоагулянта и крови в пробах оставались одинаковыми, а дозы туберкулинов возрастали: 0,05; 0,1 и 0,15 мл
| Таблица 1 Определение рабочей дозы туберкулинов (в среднем по группам) для КРС и свиней в РСЛЛ |
||||||||||||
| Доза антигена | КРУПНЫЙ РОГАТЫЙ СКОТ | СВИНЬИ | ||||||||||
| Количество лейкоцитов при взаимодействии «in vitro» (10 9// л) | РСЛЛ в % | Количество лейкоцитов при взаимодействии «in vitro» (10 9/ л) | РСЛЛ в % | |||||||||
| Физ.р-р | ППД, мл. | КАМ | ППД птиц | ППД, мл. | КАМ | ППД птиц | Физ. р-р | ППД мл. | ППД птиц | ППД мл. | ППД птиц | |
| 0,05 | 9,5 | 9,6 | 9,4 | 9,5 | -1% | 1% | 0 | 9,3 | 9,2 | 9,4 | 1% | 1% |
| 0,1 | 9,5 | 9,5 | 9,4 | 9,4 | 0% | 1% | 1 | 8,6 | 8,7 | 8,7 | 1% | 1% |
| 0,15 | 9,3 | 9,0 | 9,1 | 9,2 | 3% | 2% | 1 | 8,7 | 8,4 | 8,8 | 3% | 2% |
Как видно из табл.1 и 2, РСЛЛ во всех пробах не превышает 3% у крупного рогатого скота, свиней, 7,4% у собак и 2% у кроликов, поэтому экономнее в качестве рабочей дозы использовать дозу 0,05 мл туберкулина, т.к. РСЛЛ у нее оказалась ниже, чем при дозе 0,15. И величина ее была практически одинаковой для ППД млекопитающих, ППД птиц и КАМ.
Таким образом, рабочая доза туберкулинов определена величиной 0,05 мл для РСЛЛ.
Пример 2. Специфичность и активность РСЛЛ крови бычков, вакцинированных БЦЖ-1
В опытах на 4-6-месячных бычках изучали специфичность и активность РСЛЛ. Для этого животным вводили живые микобактерии вакцинного штамма БЦЖ-1 в прививочных дозах: 0,05 мг, 0,15 мг, 0,25 мг и 0,50 мг (одна, три, пять, десять доз), а затем исследовали кровь в РСЛЛ в день вакцинации и через каждые 24 часа в течение 10 суток (240 часов).
Количество лейкоцитов в пробах крови с ППД для млекопитающих колебалось от 8,2 до 9,1·10 9 /л. Отличительно, что в пробах крови от бычков, вакцинированных БЦЖ, при взаимодействии с ППД для млекопитающих отмечали снижение количества лейкоцитов через 48-120 часов после введения вакцины по сравнению с другими пробами, однако число их было в границах нормы.
В эти же часы после введения живых микобактерий в пробах крови с физиологическим раствором ППД для птиц и КАМ количество лейкоцитов практически было одинаковым и колебалось от 9,2 до 11,3·10 9 /л, т.е. обнаруживали лейкоцитоз, который был тем сильнее, чем больше была прививочная доза микобактерий вакцинного шт. БЦЖ-1.
Как видно из табл.3, в пробах крови с ППД для млекопитающих положительная РСЛЛ обнаруживалась уже через 24 часа после сенсибилизации КРС вакциной БЦЖ, в пробах крови с ППД для птиц и КАМ показатели РСЛЛ были отрицательными.
| Таблица 3 Показатели РСЛЛ у крупного рогатого скота сенсибилизированного вакциной БЦЖ с туберкулинами: ППД для млекопитающих, ППД для птиц и КАМ |
||||||||||||
| Время после вакцинации, ч | ||||||||||||
| Одна (0,05 мг) | Три (0,15 мг) | Пять (0,25 мг) | Десять (0,50 мг) | |||||||||
| ППД мл. | ППД пт. | КАМ | ППД мл. | ППД пт. | КАМ | ППД мл. | ППД пт. | КАМ | ППД мл. | ППД пт. | КАМ | |
| в день сенсибилизации | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1,2 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 |
| 24 | 14 | 0 | 1 | 14,3 | 0 | 0 | 16,2 | 1 | 1 | 34,3 | 1 | 1 |
| 48 | 27 | 0 | 0 | 32,5 | 0 | 0 | 28,6 | 1 | 0 | 48,3 | 0 | 0 |
| 72 | 23 | 0 | 1 | 25,5 | 0 | 1 | 21,6 | -1 | 1 | 41,3 | -1 | 1 |
| 96 | 17 | 0 | 0 | 10,8 | 0 | 0 | 19,5 | 0 | 0 | 35 | 0 | 1 |
| 120 | 13 | 0 | 0 | 5 | 1 | 0 | 10,3 | 0 | 0 | 24,2 | 0 | 1 |
| 144 | 7 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 6,3 | 0 | 1 | 20 | 1 | 1 |
| 168 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 2,4 | 0 | 1 | 15,1 | 0 | 1 |
| 192 | 1 | 0 | 0 | 1,2 | 0 | 1 | 8,6 | 0 | 1 | |||
| 216 | 0 | 0 | 0 | 6 | -1 | 1 | ||||||
| 240 | 0 | 0 | 0 | |||||||||
| - ППД пт. - ППД для птиц |
Полученные результаты исследований свидетельствуют о специфичности РСЛЛ. РСЛЛ может быть использована для выявления животных, сенсибилизированных микобактериями с антигенами, родственными туберкулину.
Активность РСЛЛ характеризуется тем, что с повышением дозы живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ-1 с 0,05 мг до 0,50 мг на животное возрастает показатель РСЛЛ.
Так, установлено, что при вакцинации одной прививочной дозой БЦЖ-1 наибольший показатель РСЛЛ с ППД для млекопитающих был через 48-72 ч после инъекции (27-23%)
При сенсибилизации крупного рогатого скота тремя прививочными дозами положительные показатели РСЛЛ также наблюдаются в это же время. Максимальный процент лизиса достигает 32,5% после введения вакцины БЦЖ.
При введении животным пяти прививочных доз лизис лейкоцитов был более продолжительным и имел тенденцию к увеличению показателя. Особенно четко эта тенденция наблюдалась при введении животным 10 прививочных доз вакцины БЦЖ, когда лизис лейкоцитов через 48 часов после инъекции вакцины достигал 48,3% и был более продолжительным, т.е. с увеличением количества прививочных доз процент сенсибилизированных лейкоцитов возрастал и это сказывалось на показателях РСЛЛ (табл.3).
Результаты показателей РСЛЛ в зависимости от количества прививочных доз вакцины БЦЖ-1 свидетельствуют о выраженной активности РСЛЛ.
Так, среднесуточный показатель РСЛЛ с ППД для млекопитающих за 120 часов при одной прививочной дозе микобактерии БЦЖ составил 18,8%, трех - 20,8%, пяти - 19,24% и десяти - 32,2%. При десяти прививочных дозах БЦЖ положительные показатели РСЛЛ с ППД для млекопитающих удлиняются до семи суток.
Выполненные исследования с инъекциями живых микобактерии вакцинного шт. БЦЖ позволили установить специфичность и активность РСЛЛ, что необходимо для дифференциальной диагностики специфических и неспецифических реакций на туберкулин.
Пример 3. Исследование по определению у свиней сенсибилизации, вызванной введением живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ-1
Опыты выполняли на поросятах-отъемышах трех групп, которым инъекцировали по одной, три и пять прививочных доз вакцины БЦЖ. Количество лейкоцитов у сенсибилизированных свиней одной дозой вакцины БЦЖ с ППД для млекопитающих колебалось от 7,2 до 8,8·10 9 /л, а с физиологическим раствором ППД для птиц колебания составляли от 8,7 до 14,3·10 9 /л. Наибольшее количество лейкоцитов было через 48 часов после вакцинации. Та же закономерность отмечалась при введении трех и пяти прививочных доз вакцины БЦЖ, где количество лейкоцитов с физиологическим раствором и ППД для птиц через 48 часов достигало 15,4 и 18,6·10 9 /л соответственно. В результате показатель РСЛЛ с ППД для млекопитающих у сенсибилизированных свиней через 24 часа при одной прививочной дозе составил 26,9%, трех - 28,9%, пяти - 38,1%. Наибольший показатель РСЛЛ был через 48-72 часов после сенсибилизации и составил 46,6-49,7%; 41,5-46,7%; 49,7-55,4% соответственно дозам (табл.4).
| Таблица 4 Показатели РСЛЛ у свиней, сенсибилизированных вакциной БЦЖ с туберкулинами: ППД для млекопитающих, ППД для птиц |
||||||
| Время после вакцинации, ч | Количество прививочных доз вакцины БЦЖ | |||||
| Одна (0,05 мг) | Три (0,15 мг) | Пять (0,25 мг) | ||||
| ППД мл. | ППД птиц | ППД мл. | ППД птиц | ППД мл. | ППД птиц | |
| в день сенсибилизации | -1 | 0 | 0,9≈1 | 0 | 0 | 1 |
| 24 | 26,9 | 1 | 28,9 | 1 | 38,1 | 0 |
| 48 | 49,65 | 1 | 46,7 | 1 | 55,4 | 0 |
| 72 | 46,61 | 0 | 41,5 | 1 | 49,7 | 1 |
| 96 | 34,45 | 0 | 26,9 | 1 | 19 | 0 |
| 120 | 17,82 | 0 | 20,9 | 1 | 13 | 0 |
| 144 | 1,15 | -1 | 7,8 | 0 | 6,4 | 1 |
| 168 | 0 | 0 | 1,8 | 1 | 1,8 | -1 |
| 192 | 0 | 1 | ||||
| - ППД мл. - ППД для млекопитающих | ||||||
| - ППД пт. - ППД для птиц |
У вакцинированных поросят положительные показатели РСЛЛ обнаруживали через 24-120 часов после введения одной, трех и пяти прививочных доз вакцины БЦЖ.
РСЛЛ с ППД для птиц была отрицательной, что подтверждает специфичность РСЛЛ с ППД для млекопитающих.
Пример 4. Исследование по определению у собак сенсибилизации, вызванной введением живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ-1
В опытах на собаках после введения одной, трех, пяти прививочных доз вакцины БЦЖ установлено, что через 24-72 часа при взаимодействии крови с физиологическим раствором численность лейкоцитов составила 5,2-6,2 10 9 /л, а с ППД для млекопитающих 3,4-4,7 10 9 /л, т.е. отмечалась лейкопения.
Количество лейкоцитов с физиологическим раствором было увеличено по сравнению с нормой в два и более раз. В результате показатели РСЛЛ составили при одной дозе 14-25%, при трех 20,8-60,6%, при пяти 22-68%. Наибольший показатель РСЛЛ был через 48 часов после вакцинации. Положительные показатели РСЛЛ отмечали при одной дозе через 24-96 часов, при трех через 24-120 часов, при пяти через 24-240 часов, т.е. с увеличением дозы вакцины увеличивалась продолжительность сенсибилизации лейкоцитов и возрастала активность - показатели РСЛЛ (табл.5).
| Таблица 5 Показатели РСЛЛ у собак и кроликов, сенсибилизированных вакциной БЦЖ |
|||||||||
| Время после вакцинации (час) | Количество прививочных доз вакцины БЦЖ | ||||||||
| СОБАКИ | КРОЛИКИ | ||||||||
| одна (0,05 мг) | три (0,15 мг) | пять (0,25 мг) | пять (0,25 мг) | десять (0,50 мг) | |||||
| ППД мл. | ППД мл. | ППД мл. | ППД мл. | ППД птиц | КАМ | ППД мл. | ППД птиц | КАМ | |
| В день сенсибилизации | 1 | 0 | 0,7 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 |
| 24 | 24 | 45,9 | 60,5 | 58 | 1 | 0 | 56 | 1 | 0 |
| 48 | 25 | 60,6 | 68 | 71 | 0 | 0 | 72 | 0 | 0 |
| 72 | 23 | 50 | 63,8 | 71 | 0 | 1 | 41 | 1 | 0 |
| 96 | 14 | 43,6 | 62,6 | 36 | 1 | 0 | 26 | 1 | 0 |
| 120 | 1,9 | 20,8 | 57,4 | 2 | 0 | 1 | 30 | 0 | 1 |
| 144 | 1 | 3,4 | 54,9 | 0 | 1 | 0 | 25 | 0 | 0 |
| 168 | 1 | 1 | 41,2 | 0 | 0 | 0 | 19 | 0 | 1 |
| 192 | 0 | 0 | 0 | 0 | 17 | 1 | 1 | ||
| 216 | 32 | 0 | 0 | 1 | 17 | 0 | 0 | ||
| 240 | 22 | 0 | 1 | 0 | 13,7 | 0 | 0 | ||
| 264 | 0 | 0 | 1 | 1 | 16,0 | 1 | 0 | ||
| 288 | 1,4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | ||
| 336 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | |||
| 408 | 23 | 1 | 1 | ||||||
| 672 | 1 | 0 | 0 | ||||||
| - ППД мл. - ППД для млекопитающих | |||||||||
| - ППД пт. - ППД для птиц |
Пример 5. Исследование по определению у кроликов сенсибилизации, вызванной введением живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ-1
При вакцинации кроликов пятью прививочными дозами вакцины БЦЖ самое низкое содержание лейкоцитов в крови при взаимодействии с ППД для млекопитающих обнаруживали через 24 и 72 часа (4,6-4,7 10 9 /л), а при десяти дозах наименьшее количество лейкоцитов при взаимодействии с ППД для млекопитающих было через 24 часов (3,8 10 9 /л) и 48 часов (4, 7 10 9 /л). Особенностью является то, что при взаимодействии крови с ППД для млекопитающих через 72-264 часа и через 408 часов после вакцинации количество лейкоцитов было в несколько раз выше, чем в норме, и составляло 11-28,5 10 9 /л, т.е. вместо лейкопении отмечался лейкоцитоз. И в это же время количество лейкоцитов в пробах с физиологическим раствором (контрольные пробы) значительно превышало численность их в опытных пробах и составляло 25,0-38,7 10 9 /л. Установлено, что на фоне лейкоцитоза, вызванного введением больших доз вакцины БЦЖ, РСЛЛ у кроликов была положительной и составляла от 13,7 до 72% (табл.5).
Пример 6. Исследование проб крови РСЛЛ коров, давших дважды положительную реакцию на туберкулин
Диагностику туберкулеза реакций специфического лизиса лейкоцитов РСЛЛ в производственных условиях выполняли в СПК « Рассвет» Матвеево-Курганского района.
В октябре 2006 г. на ранее благополучной ферме положительно прореагировали на туберкулин семь коров из 198 исследованных. При повторной туберкулинизации через 45 дней они вновь дали положительную реакцию. При внутрикожном введении туберкулина образовывались тестоватой консистенции разлитые припухлости, кожная складка утолщалась на 5-10 мм.
Перед убоем коров взяли кровь для исследования в реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ). Результаты исследований по количеству лейкоцитов и показателям РСЛЛ у коров, с выраженной реакцией на туберкулин, представлены в табл.6.
| Таблица 6 РСЛЛ и патологоанатомические данные у коров, положительно прореагировавших на туберкулин |
|||||||
| Инвентарные номера коров | Кол-во лейкоцитов и показатель РСЛЛ крови при взаимодействии с | ||||||
| Физиологич. раствор | ППД для мл. | ППД для птиц | КАМ | ||||
| кол-во лейк. | кол-во лейк. | РСЛЛ% | кол-во лейк. | РСЛЛ% | кол-во лейк. | РСЛЛ% | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 6827 | 7,7 | 5,5 | 29 | 7,6 | 1 | 7,55 | 2 |
| 071 | 11,0 | 7,1 | 36 | 11,0 | 0 | 10,5 | 1 |
| 4006 | 5,05 | 5,0 | 1 | 5,0 | 1 | 5,05 | 1 |
| 4018 | 9,5 | 2,75 | 71 | 9,35 | 2 | 9,4 | 1 |
| 162 | 5,0 | 4,8 | 4 | 4,9 | 1 | 4,9 | 1 |
| 109 | 5,0 | 4,9 | 2 | 5,0 | 0 | 4,9 | 1 |
| 148 | 5,75 | 4,2 | 27 | 5,7 | 1 | 5,7 | 1 |
Как видно из табл.6, из семи коров, реагировавших на внутрикожное введение туберкулина, только у четырех РСЛЛ была положительна (инвен. №6827; №071; №4018; №148) при взаимодействии проб крови с ППД-туберкулином для млекопитающих. Пробы крови с ППД-туберкулином для птиц и КАМ дали отрицательные показатели РСЛЛ.
Ветеринарная экспертиза контрольно-диагностического убоя положительно реагирующих на туберкулин коров показала, что из четырех животных с положительными показателями РСЛЛ только у двух обнаружены в лимфатических узлах изменения, характерные для туберкулеза: у одной туши в подчелюстных и заглоточных, а у второй средостенных и брыжеечных лимфатических узлах. В тушах двух коров с положительной реакцией на туберкулиновую пробу и положительными показателями РСЛЛ патологоанатомических изменений, характерных для туберкулеза, во внутренних органах и лимфатических узлах визуально не обнаружено. Это, вероятно, связано с недавним инфицированием животных возбудителем туберкулеза, и патологоанатомические изменения еще не успели сформироваться. Кроме этого, при послеубойной контрольно-диагностической экспертизе было установлено, что положительные реакции на внутрикожное введение туберкулина дали две глубокостельные (7-8,5 мес. беременности) коровы и одна с острым эндометритом при стрептококковой инфекции. Патологоанатомические изменения у положительно прореагировавших на туберкулин коров показаны в табл.7.
| Таблица 7 Патологоанатомические изменения у положительно прореагировавших на туберкулин коров |
|
| Номер коров | Патологоанатомические изменения |
| 6827 | Патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах не обнаружено |
| 071 | Надартериальный лимфатический узел гиперимирован, печеночный лимфатический узел на разрезе имеет саловидные фокусы, других патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах не обнаружено |
| 4006 | Послеродовой эндометрит, других патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах не обнаружено |
| 4018 | Подчелюсной левый лимфатический узел на разрезе имел некротические фокусы серо-белого цвета, других патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах не обнаружено |
| 162 | Патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах не обнаружено, стельность 7 месяцев |
| 109 | Патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах не обнаружено, стельность 7,5 месяцев |
| 148 | Патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах не обнаружено, стельность 8 месяцев |
Контрольно-диагностическая экспертиза убитых коров, реагировавших положительно на туберкулин, показала, что в четырех случаях из семи положительная туберкулиновая проба совпадала с положительной РСЛЛ (В=4:7=0,57); в одном случае (В=1:7=0,14) из трех коров с беременностью 7-8 мес. положительная туберкулиновая проба совпала с глубокостельностью (8 мес.; В=1:3=0,33); в одном случае - со стрептококковой инфекцией (острый эндометрит; В=1:7=0,14).
РСЛЛ в двух случаях из четырех положительных показателей совпадала с обнаружением патологоанатомических изменений, характерных для туберкулеза (В=2:4=0,5), и в двух случаях из четырех (В=2:4=0,5) визуальных патологоанатомических данных не обнаружено, что не может быть основанием для исключения раннего инфицирования микобактериями, когда еще патологоанатомические изменения не сформировались.
Литература
1. Диагностика туберкулеза. // В.П.Урбан, М.А.Сафин, А.А..Сидорчук, М.В.Харитонов, Р.С.Сигбатулин, Ф.Г. Акберов. // Практикум по эпизоотологии и инфекционным болезням с ветеринарной санитарией. Учебник. Москва: «Колос», 2003, с.82-86.
2. Эпизоотологический контроль и постановка диагноза на туберкулез у животных разных видов. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных. Сборник санитарных и ветеринарных правил. Изд. официальное. Госкомсанэпиднадзор России. Минсельхозпром России. Москва. 1996, с.164-167.
3. Наставление по проведению симультанной пробы с применением туберкулина и комплексного Аллергена из атипичных микобактерий (КАМ) при диагностике туберкулеза животных. Ветеринарное законодательство. Том 3. Москва: «Колос», 1981, с.220-224.
4. Шаров А.Н. Туберкулез «Ветеринарные препараты» Справочник (под ред. д.б.н. Д.Ф.Осидзе). Москва: «Колос», 1981, с.192-201.
1. Способ ранней диагностики туберкулеза животных, включающий выявление в благополучных хозяйствах и дворах плановыми аллергическими исследованиями реагирующих на туберкулин животных, отличающийся тем, что от положительно реагирующих на туберкулин животных исследуют кровь реакцией специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) с использованием в качестве диагностикума туберкулинов ППД для млекопитающих, ППД для птиц и КАМ.
2. Способ ранней диагностики туберкулеза по п.1, отличающийся тем, что при диагностике туберкулеза у крупного рогатого скота РСЛЛ проводят с ППД-туберкулином для млекопитающих, ППД-туберкулином для птиц и КАМ-комплексным аллергеном из атипичных микобактерий.
3. Способ ранней диагностики туберкулеза по п.1, отличающийся тем, что при диагностике туберкулеза у свиней РСЛЛ выполняют с ППД-туберкулином для млекопитающих и ППД-туберкулином для птиц.
// 2341288 // 2443428
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии
Изобретение относится к области биотехнологии
размер шрифта
ПРОФИЛАКТИКА И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА ЛЮДЕЙ- МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ- МУ 3-1-7-1189-03 (утв- Главным государственным... Актуально в 2018 году
5.3.2. Реакция лизиса лейкоцитов
Введение специфического антигена в сенсибилизированный организм небезразлично для обследуемого. В этой связи заслуживает внимания эффективный метод выявления гиперчувствительности замедленного типа методом in vitro с помощью реакции лизиса лейкоцитов (РЛЛ). РЛЛ основана на учете разрушения лейкоцитов сенсибилизированного организма под влиянием специфического антигена, регистрируемого методом in vitro. РЛЛ обладает строгой специфичностью, дает возможность количественного учета степени сенсибилизации организма, позволяет получить ответ через 3 - 4 часа после взятия крови.
Техника постановки РЛЛ.
РЛЛ проводится в пробирках из химически чистого стекла. В качестве антигена используется взвесь убитых нагреванием бруцелл (может быть использован вакцинный штамм В.abortus 19BA) в
7 концентрации 1 x 10 мкл/мл.
Кровь для исследования берется в количестве 1 мл и вносится в колбочку с гепарином из расчета 75 - 80 ме гепарина на 1 мл крови. По 0,4 мл гепаринизированной крови помещается в 2 пробирки. В первую пробирку добавляют 0,1 мл бруцеллезного антигена (опытная пробирка), во вторую - 0,1 мл физраствора для установления неспецифического лизиса лейкоцитов (контрольная пробирка). Пробирки встряхивают в течение 2 - 3 мин., после чего проводят подсчет лейкоцитов в камере Горяева по принятому в гематологии методу. Затем пробирки помещают в термостат на 2 часа при 37 °C и периодически встряхивают их через 15 - 20 мин. После инкубации пробирки вновь встряхивают в течение 2 - 3 мин. и проводят подсчет лейкоцитов. Подсчет производится не менее 2 - 3 раз для каждой пробирки, а затем выводится среднее их количество. Наличие лейкоцитов после инкубации в опытной и контрольной пробирках подсчитывается по формуле: количество лейкоцитов после инкубации x 100% количество лейкоцитов до инкубации.
Показатель специфического лизиса лейкоцитов (ПСЛ) подсчитывается путем определения разницы - процент уменьшения лейкоцитов в опытной пробирке минус процент уменьшения лейкоцитов в контроле. ПСЛ выражается отрицательной величиной и колеблется в пределах от -10 до -30%. ПСЛ меньше -10% свидетельствует о неспецифическом лизисе.
Дубовой Б.Л., Полякова О.Н. ГНУ СКЗНИВИ, г. Новочеркасск
Туберкулез причиняет огромный экономический ущерб и представляет большую опасность для здоровья людей. Пер-востепенной задачей в противотуберкулезных мероприяти-ях является своевременная диагностика, ранее выявление источника возбудителя инфекции.
Прижизненная диагностика аллергическими исследованиями запоздалая и не выявляет животных в первые дни, и даже месяцы после их заражения. Поэтому, требуются более чувствительные мето-ды, которые позволяют выявить этиологию аллергического процесса при туберкулезе.
Для дифференциации неспецифических туберкулиновых реак-ций используют симультанную пробу с аллергенами - ППД для млеко-питающих и КАМ, изготовленных из нескольких штаммов атипичных микобактерий. Симультанную аллергическую пробу применя-ют при первичной постановке диагноза на туберкулин в благополуч-ных хозяйствах и в случае, если реакции на туберкулин обусловлены атипичными микобактериями и кислотоустойчивыми сапрофитами. Также прибегают к комиссионному контрольно-диагностическому убою животных с реакцией на внутрикожное введение туберкулина, для уточнения диагноза патологоанатомическими, бактериологичес-кими исследованиями и биопробой.
Однако владельцы высокоудойных коров оспаривают право-мерность контрольно-диагностического убоя животных, давших по-ложительную реакцию на туберкулиновую пробу, и требуют прижиз-ненных способов диагностики для дополнительного исследования высокопродуктивных животных на туберкулез. Поэтому кроме симультанной аллергической пробы, патологоанатомических осмотров и лабораторных исследований, эпизоотологического обследования хозяйств, анализа динамики проявления аллергических реакций у различных групп животных, для изучения неспецифических туберку-линовых реакций у крупного рогатого скота и дифференциации их от специфических используют клеточные реакции ин витро - реакцию бласттрансформации лимфоцитов и специфического лизиса лейкоци-тов и другие реакции.
В нашем исследовании для выявления причин неспецифичес-ких туберкулиновых реакций использовали реакцию специфического лизиса лейкоцитов в сопоставлении с патологоанатомическими изме-нениями.
Постановку РСЛЛ выполняли в модификации Б.Л. Дубового.
Целью исследований явилось выявление причин неспецифичес-ких реакций, связанных с дифференциальной диагностикой туберку-леза, вызванного разными видами микобактерий, что имеет большое ветеринарно-санитарное, эпизоотическое и хозяйственное значение.
Выявление инфицированных микобактериями и больных ту-беркулезом животных реакцией специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) in vitro основана на явлении немедленно появляющейся повы-шенной чувствительности лейкоцитов к повторному контакту с антиге-ном (аллергеном) вне организма .
В производственных условиях испытания РСЛЛ для возможной диагностики туберкулеза выполняли в базовых хозяйствах Ростовской области. Так на ранее благополучной ферме восемь коров реагирова-ли на туберкулин. Их подвергли контрольно-диагностическому убою. При ветеринарно-санитарной экспертизе патологоанатомических из-менений во внутренних органах и лимфатических узлах визуально не обнаружили. Бактериологические исследования патматериала в Рос-товской областной лаборатории были отрицательными.
Перед убоем у коров взяли кровь для проведения реакции спе-цифического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ). Результаты исследований по количеству лейкоцитов и показателям РСЛЛ в пробах крови представ-лены в таблице.
Таблица. Количество лейкоцитов, показатели РОЛЛ и патологоанатомические изменения у прореагировавших на туберкулин коров.
Как видно из таблицы, во всех пробах крови с ППД-туберкулином для млекопитающих реакция специфического лизиса лейкоцитов была отрицательной, что свидетельствует об отсутствии инфицирова-ния их M. bovis.
В пробах крови четырех убитых коров реакция специфического лизиса лейкоцитов была положительна с ППД-туберкулином для птиц. Лизис лейкоцитов в пробах был 11%, 20%, 22%, 26%, что указывает на инфицирование животных M. avium.
В пробах крови четырех животных получен положительный ре-зультат РСЛЛ с КАМ. Процент лизиса лейкоцитов составил 11%, 13%, 15%, 20%, что связано с инфицированием животных при жизни ати-пичными микобактериями.
Таким образом, выполненные исследования крови с туберкулинами вне организма от животных с положительными туберкулиновы-ми пробами позволяют в короткие сроки выявить истинные причины, вызвавшие сенсибилизацию организма к туберкулину, и, главное, делают возможным исключить необоснованный убой высокопродук-тивных животных. Возможность применения способа диагностики in vitro неспецифически туберкулиновых реакций непосредственно в условиях хозяйств будет способствовать широкому применению ал-лергенов различной природы в качестве средств дифференциальной диагностики специфических и неспецифических туберкулиновых ре-акций.
Предлагаемый способ диагностики неспецифических туберкули-новых реакций рекомендуем использовать в бла-гополучных по туберкулезу хозяйствах. Для этого от всех животных, давших положительную реакцию на внутрикожное введение туберкулина, берут кровь и исследуют ее вне организма с имеющимися туберкулинами, что позволяет выявить этиологию туберкулиновых реакций, вызванных микобактериями различных видов.
Список литературы
- Верховский, О.А. Диагностическое значе-ние реакций клеточного иммунитета при туберкуле-зе крупного рогатого скота / О.А. Верховский, А.Х. Найманов, О.А. Савицкая // Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии живот-ных. Материалы международной научно-практи-ческой конференции Москва, 16-17 мая, 2006. - М.; ИзографЪ, 2006. - С.180-186.
- Дубовой, Б.Л. Новое в дифференциальной диагностике туберкулеза сельскохозяйственных животных / Б.Л. Дубовой, О.Н. Соловьева, Н.В. Улько // Сборник научных трудов "Диагностика, про-филактика и лечение при инфекционных болезнях сельскохозяйственных животных".- Персиановский, 2000. - С.8-12.
- Дубовой, Б.Л. Исследования специфичности и активности РСЛЛ при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота / Б.Л. Ду-бовой, О.Н. Полякова // Инновационный путь развития АПК-магист-ральное направление научных исследований для сельского хозяйства. - Персиановский, 2007. - С.67-69.
- Найманов, А.Х. Дифференциация аллергических реакций на туберкулин / А.Х. Найманов // Ветеринария. - 2002. - N°3.- С.10-12.
- Наставление по проведению симультанной пробы с примене-нием туберкулина комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ) при диагностике туберкулеза животных. Ветеринарное законодательство. Т. 3, М.: "Колос", 1981.- С.220-224
- Эпизоотологический контроль и постановка диагноза на тубер-кулез у животных разных видов. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных. Сборник санитарных и ветеринарных правил. Изд. Официальное. Госкомсанэпиднадзор Рос-сии. Минсельхозпром России. Москва, 1996.- С. 164 - 167.
Реферат
Требуются более чувствительные методы, которые позволяют выявить этиологию аллергического процесса при туберкулезе. Для определения этиологии неспецифических туберкулиновых реакций в благополучных хозяйствах использовали ППД-туберкулин для птиц и КАМ вне организма с кровью животных, реагирующих на тубер-кулин для млекопитающих. Показано, что РСЛЛ можно использовать для дифференциации специфических и неспецифических реакций на туберкулин.
Ключевые слова: диагностика, туберкулез, реакция специфи-ческого лизиса лейкоцитов (РСЛЛ).
UDC 619.616.002.5
DIAGNOSTICS OF UNSPECIFIC REACTIONS TO TUBERCULINE CAUSED BY ATYPICAL AND AVIAN MYCOBACTERIES Dubovoi B.L., Polyakova O.N. Summary
More sensitive methods that can detect the etiology of allergic process at tuberculosis are required. PPD-tuberculin for birds and CAM outside the body with the blood of animals, reacting to tuberculin for mammals, were used to determine the etiology of nonspecific tuberculin reactions in wealthy economies. It is founded the RSLL can be used for the differentiation both of specific and unspecific reactions to tuberculine.
Key words: diagnostics, tuberculosis, reaction of specific lysis of leucocytes (RSLL).
About the authors
Dubovoy Boris L. - D. Sc. in Veterinary Medicine, professsor, chief of infectious diseases of farming animals and poultry research laboratory of the State scientific establishment "North Caucasian zonal veterinary research institute" of Russian Academy of agricultural sciences; 6/4. Veterinarnaya st., Novocherkassk, Rostov region, 394400; Tel.89281360864.
Responsible for correspondence with the editorial board: Polyakova Olga N.- post-graduate student of the State scientific establishment "North Caucasian zonal veterinary research institute" of Russian Academy of agricultural sciences; 28, Sadovaya st., Novocherkassk, Rostov region, 394406; Tel.89287549422
Дубовой Борис Лаврентьевич, доктор ветеринарных наук, про-фессор, заведующий лабораторией по изучению инфекционных болезней сельскохозяйственных животных и птицы ГНУ "Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт" Российской академии сельскохозяйственных наук; 394400, Ростовская область, г. Новочеркасск, ул. Ветеринарная, д.4, кв.6; тел.: 89281360864.
Ответственный за переписку с редакцией : Полякова Ольга Николаевна, аспирант ГНУ "Северо-Кавказский зональный науч-но-исследовательский ветеринарный институт" Российской ака-демии сельскохозяйственных наук; 394406, Ростовская область, г. Новочеркасск, ул. Садовая, д.28; тел.: 89287549422.
Полякова Ольга Николаевна
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ
ТУБЕРКУЛЕЗА ЖИВОТНЫХ
06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,
Микология с микотоксикологией и иммунология
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
Кандидата ветеринарных наук
Новочеркасск - 2011
Работа выполнена в Государственном научном учреждении
Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный
Институт Российской академии сельскохозяйственных наук
Научный руководитель: Доктор ветеринарных наук, профессор
Дубовой Борис Лаврентьевич
Официальные оппоненты: Доктор ветеринарных наук Попов М.А.
Доктор ветеринарных наук,
Доцент Хабузов И.П.
Ведущая организация : ГНУ Прикаспийский зональный научно-
Исследовательский ветеринарный институт
Россельхозакадемия
На заседании диссертационного совета Д 006.106.01 при Государственном научном учреждении Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук.
346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Северо-Кавказский зональный Научно-исследовательский ветеринарный институт Россельхозакадемии – 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0.
Ученый секретарь
диссертационного совета, д.б.н. А.М. Ермаков
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Борьба с туберкулезом животных – важнейшая проблема. Ликвидация туберкулеза животных имеет не только ветеринарное, но и экономическое и эпидемиологическое значение.
Наиболее важным в системе противотуберкулезных мероприятий является своевременное выявление зараженных животных и удаление их из стада как источника возбудителя туберкулеза.
В связи с этим при постановке диагноза на туберкулез особенно важна дифференциация специфических и неспецифических реакций на внутрикожное введение туберкулина.
Одной из важнейших задач профилактики туберкулеза сельскохозяйственных животных является совершенствование диагностики, так как существующие методы не обеспечивают обнаружение больных животных в начальной стадии болезни.
Проблема совершенствования диагностики туберкулеза животных имеет своей целью поиск способа ранней доклинической диагностики болезни и решения ряда задач, связанных с дифференциальной диагностикой туберкулеза, туберкулиновых реакций, вызванных сенсибилизацией организма атипичными микобактериями и птичьим видом. Поэтому необходим способ диагностики, который в кратчайший срок поможет выявить инфицированное и больное животное и предотвратить неоправданный и необоснованный убой высокопродуктивных животных.
Цель исследования - разработать способ ранней диагностики туберкулеза животных и дифференциации специфических и неспецифических реакций на внутрикожное введение туберкулина.
Достижение намеченной цели осуществлялось решением следующих задач:
1) определить рабочую дозу аллергена;
2) изучить специфичность и активность реакции лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) in vitro с аллергенами: ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ;
3) исследовать возможность использования реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) для дифференциации специфических и неспецифических реакций у положительно реагировавших на туберкулин коров.
Научная новизна. Разработан способ ранней диагностики туберкулеза, позволяющий в течение суток после заражения выявить инфицированное животное и дифференцировать туберкулиновые специфические реакции от неспецифических. Использование реакции специфического лизиса лейкоцитов с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ позволило выявить неспецифическую сенсибилизацию организма, вызванную атипичными микобактериям.
Научная новизна подтверждена патентом на изобретение №2366454 «Способ ранней диагностики туберкулеза животных».
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Ранняя диагностика туберкулеза животных.
2. Дифференциация туберкулиновых реакций.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных научно-практических конференциях ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет», ГНУ Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт РАСХН в 2006-2010 гг. и на всероссийских и международной научно-практических конференциях гг. Махачкала, Казань, Новочеркасск.
Реализация результатов исследований. Результаты исследований используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по эпизоотологии в ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет», проходят апробацию в областной ветеринарной лаборатории, СББЖ г. Новочеркасска, СПК «Рассвет», Матвеево-Курганского района, ОАО «Южное», Сальского района и СПК «Советинский», Неклиновского района, Ростовской области.
Публикации по теме. По материалам диссертационной работы опубликовано 15 научных работ, три из них - в рецензируемом издании, рекомендованном ВАК РФ и патент РФ на способ диагностики.
Практическая значимость. Полученный научный материал позволяет обнаружить инфицированное животное в первые сутки после заражения и отличить положительные неспецифические туберкулиновые реакции, вызванные атипичными и птичьими микобактериями от специфических, что имеет важное практическое значение для сохранения животных с неспецифическими туберкулиновыми реакциями. РСЛЛ рекомендуется применять при ретроспективной диагностике туберкулеза и дифференциальной диагностике специфических и неспецифических реакций на введение ППД–туберкулина для млекопитающих при внутрикожной туберкулиновой пробе.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 153 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы. В диссертации приведены 28 таблиц. Список литературы включает 264 источника, в том числе 58 иностранных авторов.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы исследований. Работу проводили на кафедре эпизоотологии ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет», в учхозе «Донское» (ДонГАУ, пос. Персиановский), в лаборатории ГНУ СКЗНИВИ, в промышленном районе города Новочеркасска, в хозяйствах Матвеево-Курганского, Неклиновского и Сальского районов Ростовской области.
Для проведения опытов отобрали животных (крупный рогатый скот, свиней, собак и кроликов), у которых физиологические и гематологические показатели находились в пределах нормы. Были сформированы пять опытных и одна контрольная группа животных. Контрольную группу сформировали для сравнения с опытной для доказательства специфичности реакции. Каждая опытная и контрольная группа состояла из пяти животных.
В процессе выполнения работы изучали гематологические показатели свежей крови (количество лейкоцитов) и реакцию специфического лизиса лейкоцитов крупного рогатого скота, свиней, собак, кроликов.
Животных опытных групп разделили на пять групп в зависимости от дозы вводимой вакцины, чтобы определить интенсивность реакции. После введения животным опытных групп живых микобактерий вакцины БЦЖ, а животным контрольных групп вакцины против бруцеллеза шт.82 брали кровь. Кровь от животных при каждом заборе делили на опытные и контрольные пробы. Контрольные пробы - кровь с добавлением 3,8% раствор цитрата натрия и физиологическим раствором, опытные пробы – кровь с добавлением 3,8% раствора цитрата натрия с ППД-туберкулином для млекопитающих, ППД-туберкулином для птиц и КАМ.
В опытных и контрольных пробах подсчитывали количество лейкоцитов, чтобы в последующем определить процент лизиса лейкоцитов по формуле.
Подбор рабочей дозы аллергенов выполняли с кровью животных, у которых физиологические и гематологические показатели находились в пределах нормы, выбирая дозу, при которой, процент лизиса лейкоцитов был не более 10. Предположительный поиск аллергена находился в дозе от 0,05 до 0,15 мл.
Для постановки реакции специфического лизиса лейкоцитов использовали существующую методику определения количества лейкоцитов в крови. Подсчитывали количество лейкоцитов в опытных и контрольной пробах, рассчитывали процент лизиса лейкоцитов по формуле.
В опытную лунку планшета, содержащую 0,05 мл 3,8%-ного раствора цитрата натрия вносили 0,1 мл исследуемой крови и рабочую дозу аллергена 0,05мл. Контрольную лунку с кровью заполняли в том же объеме, но с физиологическим раствором вместо аллергена.
Пробы крови с туберкулинами, КАМ и физиологическим раствором инкубировали в термостате в течение 2 часов при +37°С, периодически легко встряхивая. Затем для разрушения эритроцитов из контрольной и трех опытных лунок брали по 0,02 мл крови и переносили в лунки планшета содержащие 0,4мл жидкости Тюрка. Подсчитывали число лейкоцитов (в камере Горяева) во всех пробах.
Затем рассчитывали процент лизиса лейкоцитов по формуле:
РСЛЛ = Лк-Ло * 100%
Где Лк и Ло – абсолютное количество лейкоцитов в контрольной и опытной пробе крови при единовременном заборе.
РСЛЛ считали положительной при показателе 10% и более.
При моделировании туберкулезного процесса для определения активности и специфичности реакции было сформировано шесть групп животных: пять опытных и одна контрольная.
Каждой опытной группе была введена определенная дозы живых микобактерий вакцины БЦЖ. Животным контрольной группы была введена одна доза противобруцеллезной вакцины шт. 82. В момент введения и через каждые 24 часа от животных брали кровь, делили ее на пробы с добавлением в нее 3,8% раствора цитрата натрия и диагностикумов для определения процента лизиса лейкоцитов, исследования чувствительности, активности и специфичности реакции.
В хозяйствах от реагировавших на туберкулин коров исследовали кровь реакцией специфического лизиса лейкоцитов. Взятую кровь делили на опытные пробы с добавлением ППД-туберкулина для млекопитающих, ППД-туберкулина для птиц, КАМ и контрольную пробу с физиологическим раствором. Подсчитали количество лейкоцитов во всех пробах и рассчитали показатель РСЛЛ.
После исследования реакции специфического лизиса лейкоцитов был проведен контрольно-диагностический убой коров, положительно реагировавших на туберкулин и послеубойная ветеринарно-санитарная экспертиза туш и внутренних органов для обнаружения патологоанатомических изменений, характерных при заболевании и для изучения этиологии вызывающих положительные реакции туберкулиновых проб при неспецифических реакциях.
Учитывали, какая доля положительных туберкулиновых проб совпадает с результатами РСЛЛ, с патологоанатомическими изменениями, характерными для туберкулеза. Какая доля составляет совпадение положительных туберкулиновых проб, РСЛЛ и патологоанатомических изменений, несвойственных туберкулезу. Сколько положительных туберкулиновых проб совпадает в РСЛЛ с ППД-туберкулином для млекопитающих, с ППД-туберкулином для птиц и КАМ. Сколько положительных туберкулиновых проб совпадает с эхинококкозом, установленным при патологоанатолическом исследовании туш убитых с диагностической целью коров.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Определение рабочей дозы ППД –туберкулина для млекопитающих, ППД-туберкулина для птиц и КАМ
Рабочую дозу диагностических аллергенов отрабатывали на цитратной крови животных, у которых физиологические и гематологические показатели находились в пределах нормы. Аллерген использовали в дозе 0,05мл, 0,1мл и 0,15мл и в таких же объемах брали физиологический раствор.
Рабочая доза не должна вызывать разрушение лейкоцитов и сенсибилизацию к аллергену, антигену и диагностическим препаратам.
В таблице показано объемное соотношение туберкулинов и КАМ с кровью и 3,8% раствором цитрата натрия.
В опытных и контрольной пробах подсчитывали количество лейкоцитов и по формуле рассчитывали процент лизиса лейкоцитов.
Реакция специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) во всех пробах крови с аллергенами у крупного рогатого скота, свиней и кроликов доходила до 3% , у собак - до 7 %. Поэтому экономнее в качестве рабочей дозы использовать дозу 0,05 мл аллергена (туберкулина или КАМ), т.к. РСЛЛ у нее оказалась ниже, чем при дозе 0,15мл. И величина ее была практически одинаковой для ППД – туберкулина для млекопитающих, ППД – туберкулина для птиц и КАМ.
Рабочая доза туберкулинов и КАМ для РСЛЛ была взята 0,05 мл, так как она оказалась экономична и не вызывала разрушения лейкоцитов.
Таблица 1.
Определение рабочей дозы туберкулинов и КАМ.
| № пробы | 3,8 % раствор Цитрата натрия | Кровь | Опытные пробы с ППД мл., ППД пт. и КАМ | Контрольные пробы с физиологическим раствором |
| 1 | 0,05 | 0,1 | 0,05 | 0,05 |
| 2 | 0,05 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
| 3 | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,15 |
3.2. Изучение специфичности и активности реакции специфического
лизиса лейкоцитов
3.2.1. Изучение специфичности и активности РСЛЛ крови крупного
рогатого скота
Опыт проводили в учхозе «Донское», Октябрьского района Ростовской области.
Для исследований отобрали тридцать голов молодняка крупного рогатого скота в возрасте четырех – шести месяцев.
Были сформированы пять опытных и одна контрольная группа животных. В каждую группу взяли по пять животных.
Животным опытных групп вводили живые микобактерии вакцинного штамма БЦЖ в прививочных дозах: одна, три, пять, семь, десять. Бычкам контрольной группы была введена одна доза вакцины против бруцеллеза из шт. 82. Затем от всех животных брали кровь для исследования реакцией специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ).
Сенсибилизированные микобактериями вакцины БЦЖ в организме лейкоциты приобретают повышенную чувствительность к антигену и при встрече вне организма (in vitro) с подобным аллергеном лизируются.
В день введения животным вакцины БЦЖ количество лейкоцитов (в среднем по группе) вне организма в пробах крови при взаимодействии с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ было практически одинаковым, что свидетельствует об отсутствии сенсибилизированных лейкоцитов микобактериями БЦЖ.
Через 24 часа после введения вакцины БЦЖ количество лейкоцитов (в среднем по группе) в пробах крови вне организма с ППД–туберкулином для млекопитающих уменьшалось в результате их лизиса, вызванного взаимодействием сенсибилизированных клеток с аллергеном. При введении бычкам одной иммунной дозы вакцины БЦЖ количество лейкоцитов составило 9,0·10 9
/л (Табл.№2), трех доз – 8,6·10 9
/л, пяти доз – 8,7·10 9
/л, семи доз – 8,6·10 9
/л, десяти доз – 7,1·10 9
/л (Р
В пробах крови с физиологическим раствором, ППД–туберкулином для птиц и КАМ количество лейкоцитов через 24 часа увеличивалось под воздействием вакцины БЦЖ на организм. При исследовании проб крови с физиологическим раствором вне организма от животных, которым инъецировали по одной дозе вакцины БЦЖ количество лейкоцитов (в среднем по группе) составило 10,5·10 9
/л, трех доз – 10,2·10 9
/л, пяти доз – 10,9 ·10 9
/л, семи доз – 12,0 ·10 9
/л, десять доз – 12,0·10 9
/л. Процент лизиса лейкоцитов в пробах крови с ППД–туберкулином для птиц и КАМ отсутствовал. Увеличение связано с реакцией организма на введенную вакцину и сопровождается лейкоцитозом. Сенсибилизированные БЦЖ лейкоциты не вступают in vitro во взаимодействие с неродственным аллергеном. Это указывает на специфичность РСЛЛ.
Во всех опытных группах животных количество лейкоцитов в пробах крови с физиологическим раствором, ППД–туберкулином для птиц и КАМ через 48 часов достигало максимального уровня. Число лейкоцитов (в среднем по группе) в пробах, содержащих физиологический раствор, ППД–туберкулин для птиц и КАМ составило при введении одной иммунной дозы БЦЖ 11,3·10 9 /л, трех доз – 11,6·10 9 /л, пяти доз – 12,1·10 9 /л, семи доз – 13,3 ·10 9 /л, десяти доз – 14,5·10 9 /л. И после 72 часов медленно начинало снижаться.
Таблица 2.
Количество лейкоцитов и показатели РСЛЛ в крови у крупного рогатого скота сенсибилизированных 1 дозой вакцины БЦЖ.
| Время после введения живых микобакте-рий БЦЖ (час.) | Кол-во лейкоцитов | Кол-во лейкоцитов | РСЛЛ% |
||||
| с | с ППДмл. | с | с | с ППДмл. | с ППДпт. | с КАМ |
|
| В момент сенсибилизации | 9,2±0,10 | 9,1±0,07 | 9,2±0,09 | 9,1±0,06 | 1 | 0 | 1 |
| 24 | 10,5±0,10 | 9,0±0,11 | 10,5±0,11 | 10,5±0,07 | 14 | 0 | 0 |
| 48 | 11,3±0,17 | 8,2±0,17 | 11,1±0,04 | 11,1±0,06 | 27 | 2 | 2 |
| 72 | 10,9±0,06 | 8,4±0,09 | 10,8±0,10 | 10,9±0,06 | 23 | 1 | 0 |
| 96 | 10,7±0,07 | 8,7±0,04 | 10,6±0,04 | 10,7±0,07 | 19 | 1 | 0 |
| 120 | 10,2±0,05 | 8,9±0,07 | 10,1±0,04 | 10,0±0,03 | 13 | 1 | 2 |
| 144 | 9,7±0,09 | 9,0±0,08 | 9,6±0,08 | 9,5±0,04 | 7 | 1 | 2 |
| 168 | 9,1±0,04 | 9,2±0,03 | 9,1±0,03 | 9,1±0,04 | -1 | 0 | 0 |
Μ ± m – среднее значение ± ошибка средней арифметической
С увеличением иммунной дозы БЦЖ количество сенсибилизированных лейкоцитов в пробах крови возрастает и при взаимодействии их in vitro с ППД–туберкулином для млекопитающих они разрушаются, в результате процент лизиса лейкоцитов увеличивается.
Через 48 часов in vitro в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих в результате лизиса происходило снижение количества лейкоцитов. При введении одной иммунной дозы БЦЖ животным число лейкоцитов при повторной встрече с аллергеном in vitro (в среднем по группе) составило 8,2·10 9 /л, трех доз – 8,0·10 9 /л, пяти доз – 7,9 ·10 9 /л, семи доз – 7,7·10 9 /л, десяти доз – 7,5·10 9 /л. Реакция специфического лизиса лейкоцитов in vitro определялась для одной иммунной дозы на животное - 27%, трех доз – 31%, пяти доз – 35%, семи доз – 42%, десяти доз – 48%. Через 72часа лизис лейкоцитов достигал при одной иммунной дозы на животное - 23%, трех доз – 28%, пяти доз – 31%, семи доз – 37%, десяти доз – 41%.
После 72 часов реакция специфического лизиса лейкоцитов снижалась во всех подопытных группах животных.
Количество лейкоцитов в крови крупного рогатого скота в последующие дни (3-7-й день) снижалось и приходило к первоначальной величине (отмеченной в день вакцинации вакциной БЦЖ) при введении одной, трех доз на 6-й день (144часа), пяти, семи доз – 7-й день (168часов) и десяти доз на 8-й день (192часа).
В пробах крови бычков, содержащих ППД-туберкулин для птиц и КАМ показатели РСЛЛ во все дни опытов были отрицательными, лизис лейкоцитов отсутствовал. Результаты свидетельствуют о специфичности реакции.
Большой процент лизиса лейкоцитов наблюдается в пробах крови животных, содержащих ППД-туберкулин для млекопитающих, а процент лизиса лейкоцитов в пробах крови содержащих ППД-туберкулин для птиц и КАМ не превышал 3%, то есть был ниже учитываемого порога. Так как лейкоциты, сенсибилизированные микобактериями БЦЖ, in vitro под воздействием специфического родственного аллергена разрушаются.
Активность РСЛЛ характеризуется тем, что при повышении дозы живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ от 0,05 мг до 0,50 мг на животное, увеличивается количество сенсибилизированных лейкоцитов и возрастает процент лизиса лейкоцитов.
С увеличением процента лизиса лейкоцитов в зависимости от введенной прививочной дозы вакцины БЦЖ наблюдается повышенная интенсивность и продолжительность реакции специфического лизиса лейкоцитов.
Выполненные исследования с введением живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ бычкам, позволили установить специфичность и активность реакции специфического лизиса лейкоцитов, что необходимо для дифференциальной диагностики специфических реакций и к другому аллергену, реакция специфического лизиса лейкоцитов с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ была отрицательной, так как количество лейкоцитов в опытных пробах крови с туберкулинами и КАМ, а также в контрольных пробах с физиологическим раствором было практически одинаковым.
Отсутствие реакции лизиса лейкоцитов у вакцинированных животных вакциной против бруцеллеза шт.82 с ППД–туберкулином для млекопитающих также указывает на специфичность реакции лизиса лейкоцитов, так как в пробах крови находятся лейкоциты, сенсибилизированные другим неродственным аллергеном.
3.2.2. Изучение специфичности и активности РСЛЛ крови свиней
при введении живых микобактерий вакцины БЦЖ
Для опыта были отобраны 30 голов поросят трехмесячного возраста, принадлежащих гражданам города Новочеркасска.
Поросят разделили на пять групп по 5 голов в каждой, которым подкожно инъецировали по одной, две, три, четыре и пять прививочных доз вакцины БЦЖ.
Количество лейкоцитов (в среднем по группе) у свиней в день введения микобактерий вакцины БЦЖ во всех пробах колебалось от 10,7 до 10,9·10 9 /л, т.е. было в физиологических пределах.
Через 24 часа после введения вакцины в пробах крови с физиологическим раствором, ППД–туберкулином для птиц и КАМ количество лейкоцитов было примерно одинаковым. При введении одной иммунной дозы 11,8 - 11,9·10 9 , двух доз 13,2·10 9 , трех доз 14,8 - 14,9·10 9 , четыре доз 15,4 - 15,5·10 9 , пяти доз 15,8 - 15,9·10 9 , т.к. сенсибилизированные лейкоциты в реакцию с физиологическим раствором и неродственными аллергенами не вступают, и лизис лейкоцитов отсутствует.
В пробах крови от вакцинированных БЦЖ поросят, несмотря на лейкоцитоз в организме, in vitro в пробах крови при взаимодействии с ППД–туберкулином для млекопитающих количество лейкоцитов стало уменьшаться через 24 часа в результате лизиса сенсибилизированных клеток при встрече с родственным аллергеном. При введении поросятам одной иммунной дозы вакцины БЦЖ, количество лейкоцитов in vitro (в среднем по группе) равнялось 10,5·10 9
/л, двух, трех, четырех доз – 10,0 ·10 9
/л, пяти доз - 9,9 ·10 9
/л (Р
Через 48 часов количество лейкоцитов в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих in vitro достигло минимального значения. Затем количество лейкоцитов увеличивалось. Лизис лейкоцитов составил соответственно введенным дозам 33%, 41%, 47%, 52%, 55%. Через 48 часов отмечался наибольший процент лизиса лейкоцитов в опытных пробах.
В пробах крови, содержащих физиологический раствор, ППД-туберкулин для птиц и КАМ, количество лейкоцитов повышалось и достигло своего максимального значения через 48 часов с момента введения поросятам вакцины БЦЖ. С увеличением дозы введенной вакцины БЦЖ увеличивалось количество лейкоцитов в пробах крови, содержащих физиологический раствор, ППД–туберкулин для птиц и КАМ, то есть возрастание дозы микобактерий БЦЖ сопровождалось увеличением лейкоцитоза в организме, следовательно, повышалось количество лейкоцитов в пробах крови с неспецифическими аллергенами (опытные пробы) и с физиологическим раствором (контрольная проба). Затем (через 72 часа) наблюдали снижение числа лейкоцитов, в этих пробах крови.
У вакцинированных свиней положительные показатели РСЛЛ в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих обнаруживали через 24 – 120 часов после введения одной, двух, трех, четырех доз и через 24-144 часа при пяти прививочных дозах вакцины БЦЖ.
В опытах, проведенных на поросятах, количество лейкоцитов в пробах крови, содержащих ППД–туберкулин для птиц и КАМ, было аналогичным, как в пробах с физиологическим раствором. РСЛЛ в пробах крови с ППД–туберкулином для птиц и КАМ была отрицательной, что подтверждает специфичность РСЛЛ с ППД–туберкулином для млекопитающих.
У свиней, вакцинированных вакциной против бруцеллеза шт. 82, количество лейкоцитов в пробах крови с туберкулином и физиологическим раствором было практически одинаковым, следовательно, РСЛЛ с ППД – туберкулином для млекопитающих, ППД – туберкулином для птиц и КАМ была отрицательной, т.к. лейкоциты, сенсибилизированные другим аллергеном в реакцию с физиологическим раствором и неродственными аллергенами не вступают и лизис лейкоцитов отсутствует. Это свидетельствует о специфичности реакции.
3.2.3. Изучение специфичности и активности РСЛЛ крови собак
при введении живых микобактерий вакцины БЦЖ
Опыты проводили на собаках, принадлежащих гражданам города Новочеркасска Ростовской области.
Сформировали пять опытных и одну контрольную группу животных. В каждой группе находилось по 5 собак.
Для проведения исследований собакам подкожно инъецировали одну (0,05мл), две (0,1мл), три (0,15мл), четыре (0,2мл) и пять (0,25мл) прививочных доз вакцины БЦЖ. Животным контрольной группы вводили одну дозу вакцины против бруцеллеза шт. 82.
В день введения вакцины БЦЖ количество лейкоцитов во всех пробах крови по группам in vitro было практически одинаковым.
Через 24 часа после введения животным микобактерий БЦЖ при взаимодействии крови с физиологическим раствором вне организма количество лейкоцитов (в среднем по группе) составило при введении одной прививочной дозы вакцины БЦЖ - 6,1·10 9 /л, двух доз - 6,9·10 9 /л, трех доз - 7,4·10 9 /л, четырех доз - 7,7·10 9 /л, пяти доз - 8,3·10 9 /л. В пробах крови с ППД–туберкулином для птиц и КАМ были получены данные, близкие к таковым в пробах крови с физиологическим раствором. Обнаруживали лейкоцитоз, так как организм реагирует на введение вакцины БЦЖ, и сенсибилизированные лейкоциты не вступают во взаимодействие с неродственными антигенами.
При дальнейшем исследовании обнаружили, что через 48 часов количество лейкоцитов (в среднем по группе) в пробах крови in vitro, содержащих физиологический раствор, достигло максимального уровня, при введении одной иммунной дозы вакцины - 6,2·10 9 /л; двух доз - 7,4·10 9 /л; трех доз - 8,5·10 9 /л; четырех доз - 9,5·10 9 /л; пяти доз - 10,8·10 9 /л. Количество лейкоцитов в пробах крови, содержащих физиологический раствор, было большим в два и более раза по сравнению с количеством лейкоцитов в день введения вакцины. Затем количество лейкоцитов начинало повышаться. Угасание реакции связано с вырабатыванием иммунной системой нормальных антител.
В среднем по группе число лейкоцитов в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих уменьшается и достигает минимума через 48 часов при введении одной дозы БЦЖ - 4,6·10 9 /л; двух доз - 3,8·10 9 /л; трех доз - 3,4·10 9 /л; четырех доз - 3,3·10 9 /л; пяти доз - 3,1·10 9 /л. Лизис лейкоцитов в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих был наибольшим и составил при введении одной дозы БЦЖ - 26%, двух доз - 49%, трех доз - 60%, четырех доз - 65%, пяти доз - 71%. Чем выше доза введенной вакцины БЦЖ, тем больший процент лизиса лейкоцитов. При введении больших доз возбудителя в организме наступает сильная аллергия и больше сенсибилизированных лейкоцитов разрушается при встрече с родственным (специфическим) антигеном, что видно из опытов в РСЛЛ вне организма.
Установлено, что через 72 часа количество лейкоцитов (в среднем по группе) в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих увеличивалось, а в пробах с физиологическим раствором с ППД–туберкулином для птиц и КАМ уменьшалось. Процент лизиса лейкоцитов через 72часа в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих равен при введении одной иммунной дозы 23%, двух доз - 39%,трех доз - 50 %, четырех доз - 60%, пяти доз - 64%.
Положительные показатели реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) в пробах крови, содержащих ППД-туберкулин для млекопитающих, отмечали при введении одной дозы вакцины БЦЖ через 24 – 96 часов, двух доз - через 24 -120 часов, трех доз - 24 – 120 часов, четырех доз 24 – 168 часов, пяти доз 24 – 240 часов.
Активность реакции специфического лизиса лейкоцитов характеризуется тем, что с повышением введенной дозы живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ животному возрастает показатель РСЛЛ и продолжительность сенсибилизации лейкоцитов.
Реакция специфического лизиса лейкоцитов в пробах крови опытных групп, содержащих ППД-туберкулин для птиц и КАМ, была отрицательной и колебалась до 3%.
У вакцинированных собак одной дозой противобруцеллезной вакцины реакция специфического лизиса лейкоцитов в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ была отрицательной. Количество лейкоцитов в опытных и контрольных пробах крови с туберкулинами, КАМ и физиологическим раствором было практически одинаковым, что указывает на специфичность реакции лизиса лейкоцитов, так как в пробах крови сенсибилизированные лейкоциты не вступают во взаимодействие с неродственными антигенами.
3.2.4. Изучение специфичности и активности РСЛЛ крови кроликов
при введении живых микобактерий вакцины БЦЖ
Для поведения опытов отобрали 15 кроликов и разделили их на три группы.
После введения пяти, десяти доз микобактерий вакцины БЦЖ кроликам опытных групп и одной дозы вакцины противобруцеллезной шт. 82 животным контрольной группы, была взята кровь и разделена на пробы.
При исследовании установлено, что в день введения вакцины количество лейкоцитов во всех группах составило 7,9– 8,8·10 9 /л.
В пробах крови от кроликов, вакцинированных пятью дозами живых микобактерий вакцины БЦЖ, с физиологическим раствором в момент введения вакцины, количество лейкоцитов в среднем по группе было 8,8·10 9 /л. Затем количество лейкоцитов увеличивается и через 24 часа составило 11,3·10 9 /л, а через 48 часов достигает максимального уровня - 16,1·10 9 /л. Это связано с усилением функциональной деятельности кроветворных органов, вызванной поступающими в организм антигенами - микобактериями БЦЖ.
При взаимодействии крови вне организма с ППД–туберкулином для млекопитающих через 24 часа наблюдали самое низкое содержание лейкоцитов. Реакция специфического лизиса лейкоцитов через 24 часа равна 58%, через 48 часов - 71,4%, 72 часа - 70,5%. Максимальный процент лизиса лейкоцитов был зарегистрирован через 48 часов, затем процент лизиса лейкоцитов уменьшался. Положительная РСЛЛ с ППД–туберкулином для млекопитающих наблюдалась через 24 - 96 часов.
Количество лейкоцитов в пробах крови с ППД–туберкулином для птиц и КАМ было аналогичным, как и в пробах крови с физиологическим раствором. Реакция специфического лизиса лейкоцитов с ППД–туберкулином для птиц и КАМ была отрицательна (от -1% до 1%), что свидетельствует о специфичности реакции, так как сенсибилизированные лейкоциты не вступают во взаимодействие с чужеродными аллергенами.
Исследованиями установлено, что при введении десяти доз живых микобактерий вакцины БЦЖ, через 24 и 48 часов наименьшее количество лейкоцитов in vitro было в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих. Уменьшение количества лейкоцитов в пробах крови с однородным антигеном ППД–туберкулином для млекопитающих нельзя отнести к лейкопении, так как по существу лизис лейкоцитов произошел вне организма и лейколиз вызван усиленным разрушением сенсибилизированных лейкоцитов при воздействии специфического аллергена.
Определено, что при взаимодействии крови с ППД–туберкулином для млекопитающих процент лизиса лейкоцитов через 24 часа составлял 56%, через 48 часов - 72%, через 72 часа - 41%.
Затем количество лейкоцитов начинало повышаться и соответствовало норме через 672 часа.
В пробах крови с физиологическим раствором при введении десяти доз вакцины БЦЖ количество лейкоцитов стало повышаться через 24 часа. Наибольшее количество лейкоцитов in vitro зафиксировали через 96 часов после введения вакцины БЦЖ. Затем количество лейкоцитов медленно снижалось и соответствовало норме (число лейкоцитов в день введения вакцины) через 672 часа.
При повышении дозы живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ, увеличивается количество сенсибилизированных лейкоцитов, возрастает процент лизиса лейкоцитов и продолжительность реакции, этим характеризуется активность реакции специфического лизиса лейкоцитов.
Результаты в пробах крови с ППД–туберкулином для птиц и КАМ были практически одинаковыми с пробами крови, содержащими физиологический раствор, следовательно, РСЛЛ отсутствовала, что свидетельствует о специфичности реакции, так как лейкоциты не вступают в реакцию с чужеродными аллергенами.
У вакцинированных одной дозой противобруцеллезной вакцины шт. 82 кроликов РСЛЛ с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц, КАМ была отрицательной, так как в крови отсутствовали сенсибилизированные лейкоциты к этим аллергенам – диагностикумам. Количество лейкоцитов в пробах крови, содержащих туберкулин и физиологический раствор, у животных было практически одинаковым.
Отсутствие реакции лизиса лейкоцитов в пробах крови у вакцинированных животных вакциной противобруцеллезной шт. 82 , содержащих ППД–туберкулин для млекопитающих указывает на специфичность реакции, так как диагностикумы – аллергены не вступают в реакцию с сенсибилизированными лейкоцитами иного аллергена.
3.3. Исследование возможности использования РСЛЛ для дифференциации неспецифических реакций у коров, положительно реагировавших
на туберкулин
3.3.1. Исследование РСЛЛ крови у коров, положительно реагировавших
на туберкулин в Матвеево-Курганском районе
Диагностику туберкулеза реакцией специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) в производственных условиях выполняли в СПК «Рассвет» Матвеево-Курганского района, Ростовской области.
27 ноября 2006 г. на бойне СПК «Рассвет» был произведен комиссионный контрольно–диагностический убой семи коров, реагирующих на туберкулин, с последующим проведением послеубойной ветеринарно-санитарной экспертизы.
Перед убоем у коров взяли кровь для исследования реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ).
При исследовании установлено, что у трех (43%) коров реакция специфического лизиса лейкоцитов с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ была отрицательной, т.е. процент лизиса лейкоцитов был равен 1% - 4%.
У четырех коров (57%) лизис лейкоцитов в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих составил 27%, 29%, 36%, 71%, тогда как РСЛЛ с ППД-туберкулином для птиц и с КАМ была отрицательной.
При проведении послеубойной ветеринарно-санитарной экспертизы семи реагирующих на туберкулин коров только у четырех (57%) были положительными показателями РСЛЛ в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих. У двух (29%) из них обнаружены изменения в лимфатических узлах, характерные для туберкулеза: у одной в подчелюстном, у второй в надартериальном лимфатических узлах. В тушах двух убитых коров (29%) с положительной реакцией на туберкулиновую пробу и положительными показателями РСЛЛ, патологоанатомических изменений, характерных для туберкулеза, во внутренних органах и лимфатических узлах визуально не обнаружено. Это, связано с недавним инфицированием животных возбудителем туберкулеза, поэтому патологоанатомические изменения еще не успели сформироваться. Кроме этого установлено, что положительные реакции на внутрикожное введение туберкулина с отрицательными показателями РСЛЛ в пробах крови с ППД-туберкулином для млекопитающих были у двух (29%) глубокостельных (7 – 8,5 мес. беременности) коров и у одной (14%) - с острым эндометритом.
У семи коров (100%) с положительной туберкулиновой пробой, РСЛЛ в пробах с ППД–туберкулином для птиц и КАМ отрицательна, т.к. сенсибилизация не вызвана птичьими и атипичными микобактериями.
3.3.2. Исследование реакцией специфического лизиса лейкоцитов крови
у коров в Сальском районе, положительно реагировавших на туберкулин
В производственных условиях диагностику туберкулеза РСЛЛ выполняли в ОАО «Южное», Сальского района, Ростовской области.
24 августа 2009 г. на мясокомбинате Песчанокопского района был произведен комиссионный контрольно–диагностический убой 32 коров, реагировавших на туберкулин, с последующей ветеринарно-санитарной экспертизой.
Перед убоем у коров была взята кровь для исследования в реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ). Результаты исследований по количеству лейкоцитов и показателям РСЛЛ у коров, с выраженной реакцией на туберкулин представлены в таблице №3.
Из 32 коров, реагировавших на внутрикожное введение туберкулина, только у восьми (25%) РСЛЛ была положительна при взаимодействии проб крови с ППД – туберкулином для млекопитающих. Процент лизиса составил у коров 19%, 20%, 23,1%, 23,8%, 24,5%, 30,2%, 31%, 32,7%.
Исследованиями установлено, что в пробах с ППД–туберкулином для птиц у восьми (25%) животных лизис лейкоцитов составил 14,3%, 15,8%, 20,1%, 21%, 23,1%, 23,8%, 27,3%, 34,5%.
У семи (22%) коров положительная РСЛЛ была с КАМ. РСЛЛ составила 19%, 20%, 23,2%, 23,8%, 24,6%, 28,6%, 33,3%.
Из них у шести (19%) коров положительная РСЛЛ наблюдалась как с ППД–туберкулином для млекопитающих, так и с ППД–туберкулином для птиц. У двух коров (6,3%) положительная реакция была на ППД–туберкулин для млекопитающих, ППД–туберкулин для птиц и КАМ. У восемнадцати (56%) животных, реагировавших на внутрикожное введение туберкулина, реакция специфического лизиса лейкоцитов была отрицательна во всех пробах крови.
Послеубойный осмотр туш и внутренних органов 32 коров, реагирующих на туберкулин, показал, что из восьми (25%) коров с положительными показателями РСЛЛ в пробах крови с ППД-туберкулином для млекопитающих, только у одной (3%) обнаружены в заглоточных лимфатических узлах изменения, характерные для туберкулеза, у двух (6%) – эхинококк в печени, у трех (9%) - стельность, у двух (6%) - стельность и эхинококк в печени.
Из 32 коров, реагирующих на внутрикожное введение туберкулина, у 14 (44%) были обнаружены эхинококковые пузыри в печени и у одной (3%) - в легких. В одном случае (3%) был обнаружен гнойный абсцесс в печени. Двадцать голов (63%) были стельные, из них четыре (13%) коровы были больны эхинококкозом, а у одной (3%) обнаружены туберкулезные изменения в заглоточных лимфатических узлах.
Таблица 3.
Количество лейкоцитов, показатели РСЛЛ и патологоанатомические изменения у коров в Сальском районе, положительно прореагировавших на туберкулин.
| № | Инвентарный № | Количество лейкоцитов при взаимодействии крови с | РСЛЛ, % | Патологоанатомические изменения, стельность |
|||||
| Физ р-ром | ППД – Т для мл. | ППД – Т для пт. | К | ППД – Т для мл. | ППД – Т для пт. | К |
|||
| 1 | 5948 | 5,2 | 3,5 | 5,2 | 5,2 | 32,7 | 0 | 0 | Ст.7мес., изменения, характерные для туберкулеза в заглоточных лимф. узлах |
| 2 | 5070 | 5,8 | 4,0 | 3,8 | 5,8 | 31,0 | 34,5 | 0 | Ст.3мес. |
| 3 | 5625 | 6,3 | 4,4 | 5,0 | 6,3 | 30,2 | 20,1 | 0 | Эхинококкоз печени. |
| 4 | 4533 | 4,9 | 3,7 | 4,9 | 4,9 | 24,5 | 0 | 0 | Эхинококкоз печени. |
| 5 | 5926 | 10,5 | 8,0 | 8,0 | 8,0 | 23,8 | 23,8 | 23,8 | Ст.3мес., эхинококкоз печени. |
| 6 | 5602 | 6,5 | 5,0 | 5,0 | 6,5 | 23,1 | 23,1 | 0 | Ст.8мес. |
| 7 | 5631 | 9,5 | 7,6 | 8,0 | 9,5 | 20 | 15,8 | 0 | Ст.3мес. |
| 8 | 5563 | 10,5 | 8,5 | 8,3 | 7,5 | 19 | 21 | 28,6 | Ст.3мес., эхинококкоз печени. |
| 9 | 5916 | 5,5 | 5,0 | 4,0 | 4,4 | 9,1 | 27,3 | 20 | Эхинококкоз печени. |
| 10 | 5567 | 5,6 | 5,6 | 5,6 | 4,3 | 0 | 0 | 23,2 | Ст.6мес., эхинококкоз печени. |
| 11 | 5632 | 6,6 | 6,6 | 6,6 | 4,8 | 0 | 0 | 24,6 | Эхинококкоз печени. |
| 12 | 3016 | 4,2 | 4,2 | 3,6 | 4,2 | 0 | 14,3 | 0 | Эхинококкоз печени. |
| 13 | 5077 | 4,5 | 4,5 | 4,5 | 3,0 | 0 | 0 | 33,3 | Ст.6мес. |
| 14 | 5923 | 5,8 | 5,8 | 5,8 | 4,7 | 0 | 0 | 19 | Ст.8мес. |
| 15 | 5578 | 6,2 | 6,0 | 6,2 | 6,2 | 3,2 | 0 | 0 | Эхинококкоз печени. |
| 16 | 6626 | 5,1 | 5,1 | 5,1 | 5,1 | 0 | 0 | 0 | Эхинококкоз печени. |
| 17 | 5573 | 5,3 | 5,0 | 5,3 | 5,3 | 7 | 0 | 0 | Ст.7мес., эхинококкоз печени. |
| 18 | 5599 | 6,5 | 5,9 | 6,5 | 6,5 | 9,2 | 0 | 0 | Эхинококкоз печени. |
| 19 | 5660 | 4,8 | 4,8 | 4,8 | 4,5 | 0 | 0 | 6,3 | Эхинококкоз легких. |
| 20 | 5664 | 6,2 | 6,2 | 6,2 | 6,0 | 0 | 0 | 3,2 | Эхинококкоз печени. |
| 21 | 5538 | 5,4 | 4,9 | 5,3 | 5,4 | 9,3 | 1,8 | 0 | Эхинококкоз печени. |
| 22 | 7406 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 0 | 1,8 | 0 | Ст.7мес. |
| 23 | 5137 | 6,4 | 5,9 | 6,4 | 6,4 | 7,8 | 0 | 0 | Ст.7мес. |
| 24 | 5241 | 15,5 | 15,5 | 15,5 | 15,0 | 0 | 0 | 3,2 | Ст.5мес. |
| 25 | 5946 | 10,0 | 10,0 | 10,0 | 9,8 | 0 | 0 | 2 | Гнойный процесс в печени. |
| 26 | 5176 | 5,0 | 5,0 | 4,9 | 4,8 | 0 | 2 | 4 | Ст.8мес. |
| 27 | 5668 | 5,0 | 5,0 | 4,8 | 5,0 | 0 | 4 | 0 | Ст.8мес. |
| 28 | 4506 | 5,3 | 5,3 | 5,3 | 5,3 | 0 | 0 | 0 | Ст.4мес. |
| 29 | 6514 | 7,1 | 7,1 | 7,1 | 7,1 | 0 | 0 | 0 | Ст.3мес. |
| 30 | 5027 | 6,5 | 6,5 | 6,5 | 6,5 | 0 | 0 | 0 | Ст.6мес. |
| 31 | 6063 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 0 | 0 | 0 | Ст.6мес |
| 32 | 4922 | 6,8 | 6,8 | 6,8 | 6,8 | 0 | 0 | 0 | Ст.7мес. |
Из восьми убитых коров, у которых РСЛЛ в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих была положительной, только у одной (12,5%) были обнаружены изменения в заглоточных лимфатических узлах, характерные для туберкулеза. У семи (87,5%) убитых животных с положительной РСЛЛ патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах, характерных для туберкулеза, не обнаружено, что, вероятно, связано с недавним инфицированием этих коров возбудителем туберкулеза, и патологоанатомические изменения еще не успели сформироваться.
У семи (21%) из 32 коров, реагировавших на туберкулин, положительная реакция была в пробах крови с КАМ, что связано с инфицированием организма атипичными микобактериями.
Положительная реакция в пробах крови с ППД–туберкулином для птиц наблюдалась у восьми (25%) убитых животных, это объясняется с инфицированием коров микобактериями птичьего вида (M. avium).
Выявлены животные с положительной пробой на туберкулин, которые заражены несколькими видами микобактерий. Так, у четырех (12,5%) коров положительная реакция была в пробах с ППД–туберкулином для млекопитающих и ППД–туберкулином для птиц, у одной (3,1%) - с ППД–туберкулином для птиц и КАМ, у двух (6,3%) - с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ.
Из 32 коров, положительно реагировавших на внутрикожное введение туберкулина, у 18 коров (56%) РСЛЛ в пробах с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ была отрицательной, что связано с другими заболеваниями (эхинококкозом и т.д.) и стельностью.
Бактериологические исследования патматериала на туберкулез дали отрицательные результаты.
3.3.3. Исследование РСЛЛ крови коров в Неклиновском районе,
положительно реагировавших на туберкулин
В производственных условиях диагностику туберкулеза реакцией специфического лизиса лейкоцитов выполняли в СПК «Советинский», Неклиновского района, Ростовской области.
Восемь коров на ранее благополучной ферме положительно реагировали на туберкулин.
6 сентября 2009г. был произведен контрольно-диагностический убой коров, положительно реагирующих на туберкулин. При послеубойном осмотре патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах визуально не обнаружено. Бактериологические исследования патматериала на туберкулез в Ростовской областной лаборатории дали отрицательные результаты.
Перед убоем, у коров, реагировавших на туберкулин, взяли кровь, для проведения реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ).
Установлено, что из восьми коров с положительными туберкулиновыми пробами только у двух РСЛЛ была положительна при взаимодействии проб крови с ППД–туберкулином для млекопитающих. Процент лизиса лейкоцитов у коров равен 10% и 16%.
У трех коров реакция специфического лизиса лейкоцитов была положительна с ППД–туберкулином для птиц. Лизис лейкоцитов у животных был 26%, 20%, 20%.
В пробах крови, содержащих КАМ, были получены отрицательные результаты РСЛЛ. Процент лизиса лейкоцитов составил от 0% до 2%.
У трех коров (37,5%), реагировавших на туберкулин, РСЛЛ во всех пробах была отрицательна.
У двух убитых коров (25%) с положительной туберкулиновой пробой и давших положительную РСЛЛ в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих, патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах не выявлено, это связано с недавним инфицированием животных возбудителем туберкулеза, в связи с чем патологоанатомические изменения еще не успели сформироваться.
Положительная реакция в пробах крови с ППД–туберкулином для птиц наблюдалась у трех животных (37,5%), положительно реагировавших на внутрикожное введение туберкулина, у которых патологоанатомические изменения характерные для туберкулеза не обнаружены, что можно объяснить инфицированием коров микобактериями птичьего вида (M. avium).
Если сенсибилизация вызвана не туберкулезными микобактериями, то есть этиология сенсибилизации другая, то результаты РСЛЛ в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих будут отрицательными.
Возможность применения способа ранней диагностики туберкулеза in vitro на клетках крови непосредственно в практических условиях хозяйств будет способствовать широкому применению аллергенов различной природы в качестве средств дифференциальной диагностики специфических и неспецифических туберкулиновых реакций.
4. ВЫВОДЫ
1. Рабочая доза для реакции специфического лизиса лейкоцитов в пробе 0,1 мл исследуемой крови и 0,05 мл 3,8%-ного раствора цитрата натрия составляет 0,05мл для ППД–туберкулинов и КАМ.
2. У сенсибилизированных животных путем введении в организм животных живых микобактерий вакцины БЦЖ положительная РСЛЛ вне организма обнаружена через 24 часа после введением вакцины с аллергенами – ППД-туберкулином для млекопитающих.
3. Повышение дозы живых микобактерий вакцинного штамма БЦЖ животному сопровождается увеличением показателя РСЛЛ и продолжительности реакции, что свидетельствует о возрастании сенсибилизированных лейкоцитов и активности реакции специфического лизиса лейкоцитов.
4. В пробах крови с физиологическим раствором, ППД–туберкулином для птиц и КАМ у вакцинированных животных живыми микобактериями вакцины БЦЖ и в пробах крови с физиологическим раствором, ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ вакцинированных вакциной из штамма 82 количество лейкоцитов было одинаковым, то есть получена отрицательная РСЛЛ, что указывает на специфичность реакции, так как сенсибилизированные лейкоциты не вступают в реакцию с чужеродными аллергенами.
5. В реакции специфического лизиса лейкоцитов можно использовать много аллергенов, что позволяет дифференцировать неспецифические реакции на туберкулин.
6. Предлагаемый нами способ РСЛЛ дополняет и совершенствует комплекс существующей диагностики и дифференциальной диагностики туберкулеза животных.
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Реакция специфического лизиса лейкоцитов позволяет обнаружить инфицированное животное в первые сутки после заражения, поэтому имеет большое практическое значение для ранней диагностики туберкулеза.
2. Рекомендуем для прижизненной дифференциальной диагностики специфических и неспецифических реакций на введение ППД–туберкулина для млекопитающих применять реакцию специфического лизиса лейкоцитов, что позволит уточнить диагноз на туберкулез и предотвратить неоправданный и необоснованный убой здоровых высокопродуктивных животных.
1. Дубовой, Б.Л. Новое в дифференциальной диагностике туберкулеза сельскохозяйственных животных / Б.Л. Дубовой, О.Н. Соловьева, Н.В. Улько // Сборник научных трудов «Диагностика, профилактика и лечение при инфекционных болезнях сельскохозяйственных животных».- Персиановский, 2000.-С.8-12.
2. Дубовой, Б.Л. Метод ранней диагностики туберкулеза крупного рогатого скота РСЛЛ / Б.Л. Дубовой, О.Н. Полякова // Ветеринарная медицина домашних животных.-Казань.-№3, 2006.–С. 54-56.
3. Дубовой, Б.Л. Поиск ранней диагностики туберкулеза животных / Б.Л. Дубовой, О.Н. Полякова // Международная научно-практическая конференция «Основные проблемы, тенденции и перспективы устойчивого развития сельскохозяйственного производства».-Махачкала.-Т.2, 2006.-С.68-69.
4. Дубовой, Б.Л. Исследования специфичности и активности РСЛЛ при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота / Б.Л. Дубовой, О.Н. Полякова // Инновационный путь развития АПК-магистральное направление научных исследований для сельского хозяйства.-Персиановский.-2007.–С.67-69.
5. Полякова, О.Н. Ранняя диагностика туберкулеза свиней / Полякова О.Н., Дубовой Б.Л.// Материалы межрегиональной конференции «Интенсивные технологии в свиноводстве: проблемы и пути решения».- Персиановский.-2007.-С.124-125.
6. Полякова, О.Н. РСЛЛ у дважды положительно прореагировавших коров на внутрикожную туберкулиновую пробу / О.Н. Полякова, Б.Л. Дубовой, Н.А. Соловьев// Материалы Всероссийская научно-практическая конференция «Актуальные проблемы функциональной и морфофункциональной диагностики болезней животных».-Новочеркасск.-2007.-С.179-180.
7. Полякова, О.Н. Изучение изменений активности туберкулина-ППД для млекопитающих РСЛЛ / О.Н. Полякова, Б.Л. Дубовой // Материалы Всероссийская научно-практическая конференция «Актуальные проблемы патологии морфологии и онкологии животных».–Новочеркасск.-2007.-С.74-75.
8. Полякова, О.Н. Реакция специфического лизиса лейкоцитов при диагностики туберкулеза животных / О.Н. Полякова // Материалы Всероссийская научно-практическая конференция «Проблемы, задачи и пути научного обеспечения приоритетного национального проекта «Развитие АПК».–Новочеркасск.-2008.-С.18-19.
9. Полякова, О.Н. Изучение неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота /О.Н. Полякова // Вестник Саратовского госагроуниверситета им.Н.И.Вавилова.-№6, 2008.-С.50-53.
10. Дубовой, Б.Л. Дифференциальная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота реакцией специфического лизиса лейкоцитов / Б.Л. Дубовой, О.Н. Полякова // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Повышение продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы на основе инновационных достижений».–Новочеркасск.-2009.-С.3-7.
11. Дубовой Б.Л. Способ ранней диагностики туберкулеза животных / Б.Л. Дубовой, О.Н. Полякова, А.И. Клименко, А.В. Коваленко, Л.П. Миронова // Изобретения. Полезные модели. Официальный бюллетень №25, 2009.-С.2.
12. Полякова, О.Н. Дифференциальная диагностика внутрикожных реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих (Тмл) у коров / О.Н. Полякова, Б.Л. Дубовой, В.В. Мосейчук // Материалы Международной научно-практической конференциию «Интеграция науки, образования продовольственной безопасности российской федерации».-Персиановский.-Т.№3,2010.–С.177-180.
13. Дубовой, Б.Л. Диагностика туберкулеза дифференциацией положительных внутрикожных туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота / Б.Л. Дубовой, О.Н. Полякова, В.И. Добрелин, В.В. Мосейчук, Г.В. Горячева // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения Российского животноводства».-Новочеркасск.-2010.-С.10-13.
14. Полякова, О.Н. Реакция специфического лизиса лейкоцитов при постановке дифференциального диагноза на туберкулез / О.Н. Полякова, Б.Л. Дубовой // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения Российского животноводства».- Новочеркасск.–2010.-С.8-9.
15. Дубовой, Б.Л. Диагностика неспецифических туберкулиновых реакций, вызванных атипичными и птичьими микобактериями /Б.Л. Дубовой, О.Н.Полякова // Ветеринария Кубани. – Краснодар.-№1, 2011. – С. 21-23.
16. Полякова, О.Н.Определение причин неспецифических туберкулиновых реакций ППД-туберкулином для птиц и КАМ вне организма /О.Н. Полякова, Б.Л. Дубовой // Ветеринария Кубани. – Краснодар.-№1, 2011. – С. 8-10.
Список сокращений :
БЦЖ – сухая вакцина БЦЖ представляет собой высушенные живые микобактерии туберкулеза вакцинного штамма БЦЖ.
КАМ – комплекс атипичных микобактерий.
ППД для мл. – протеин пурифиед дериват для млекопитающих, представляет собой очищенную белковую фракцию, выделенную из культуральной жидкости возбудителя туберкулеза соответственно бычьего вида, выращенного на синтетической питательной среде.
ППД для пт. – протеин пурифиед дериват для птиц, представляет собой очищенную белковую фракцию, выделенную из культуральной жидкости возбудителя туберкулеза соответственно птичьего вида, выращенного на синтетической питательной среде.
РСЛЛ – реакция специфического лизиса лейкоцитов.
Полякова Ольга Николаевна
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА ЖИВОТНЫХ.
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
Диссертации на соискание ученой степени
Кандидата ветеринарных наук
Подписано в печать 14.01.11 Печать оперативная
Объем 1 усл.печ.лист. Заказ № 198/1 Тираж 100 экз.
Издательско-полиграфическое предприятие
ООО "МП Книга", г.Ростов-на-Дону,
Таганрогское шоссе, 106
